水产动物分子标记辅助育种研究进展.doc

水产动物分子标记辅助育种研究进展鲁翠云, 匡友谊, 郑先虎, 李超, 孙效文(淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室, 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所, 黑龙江 哈尔滨 150070)摘要：本文介绍了水产动物分子标记辅助育种技术的发展。获得与经济性状连锁的标记是开展分子标记辅助育种的基础, 因此, 本文重点介绍了获得基因/标记技术的进步, 探讨了基因/标记与性状间相互关系的复杂性, 论述了准确鉴定性状紧密连锁的基因/标记的难度, 指出难点主要源于基因组对性状的形成具有非常复杂的影响。近十年来, 已有多个利用分子标记辅助育种技术培育的品种在产业上应用, 表明这项新技术具有推动产业技术进步的作用; 同时指出了分子标记辅助育种包括全基因组选择育种的不足之处, 其根本原因在于鱼类性状的形成机制极其复杂、多变, 从而决定了分子标记辅助育种技术具有发展阶段论的特征。关键词：水产, 分子育种，数量性状基因座(QTL)分子标记辅助育种(marker assisted selection, MAS)是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种, 是分子生物学和基因组学的研究结果应用到水产养殖物种品种选育的技术。由于基因/标记代表性状的遗传基础, 因此这项技术被誉为从传统表型选择亲本提升到根据基因型选择亲本的革命性的技术进步。2009年孙效文等1对同一问题的综述和专著2认为, 开展DNA水平的标记辅助育种是科学发展的必然, 既包括育种技术的发展, 从统计学分析DNA提供的多位点选择明显优于表型性状提供的少数位点; 又包括基因/标记是性状的遗传基础, 从基因或基因组与性状的关系获得的标记是用于选择优良性状的最根本的工具。2009年至今, 基因/标记已运用到我国大多数水产养殖动物的种质鉴定和品种选育研究中, 取得了较大的进步, 具有非常好的发展前景。本文综述了水产动物分子标记辅助育种技术的研究现状, 探讨了应用标记辅助育种技术的难点以及未来的发展方向。1 水产动物分子标记辅助育种的相关基础研究进展1.1 水产动物DNA分子标记的开发DNA分子标记的种类很多, 主要包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、扩增片段长度多态性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)、简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)和单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP)。由于RAPD标记和AFLP标记呈显性遗传, 难以检测到隐性等位基因, 在连锁分析中容易丢失位点; 而RFLP标记虽然呈共显性遗传, 但是其技术流程相对繁琐, 因此, 逐渐被新型的分子标记技术所取代。SSR标记和SNP标记因其多态性高、共显性遗传、易于规模化检测等优势成为理想的分子标记。同时, 得益于二代测序技术的进步, 使SSR和SNP标记的开发成本大大降低, 一次测序就可以获得几十万甚至上百万个标记3,4。SNP标记仅鉴定一个核苷酸位点的碱基组成, 在实验室的检测难度和工作量高于SSR标记, 更适合规模化和自动化的检测。因此, 目前多数实验室SSR标记以PCR产物的电泳检测分型为主, 而SNP标记以高通量的测序或芯片检测分型为主5。1.2 经济性状连锁的基因及功能分析Growth hormone receptor,GHR自上世纪八十年代, 很多鱼类的基因被克隆, 其中生长激素 (growth hormone, GH)基因很可能是最早克隆的基因, 也是最早用于水产种质鉴定和品种选育的基因6。1988年发现虹鳟(Oncorhynchus mykiss)GH基因有2种结构类型7, 有意思的是这2种类型的基因在鲑科鱼类中普遍存在, 并且多数具有与性别连锁的特征8,9。与GH紧密相关的另一个基因是生长激素受体 (growth hormone receptor, GHR)基因, 生长激素与其受体结合起到调节骨骼、肌肉生长, 最终达到促进生长的作用。在养殖鱼类中已经克隆了多个GHR基因的亚型10-12, 但是与GH基因被广泛地用于水产育种研究不同, GHR基因很少用到, 仅有一些应用性的探索13,14。用到品种选育的基因还有胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGF)及其受体, 白俊杰团队在大口黑鲈(Micropterus salmoides)新品种的选育过程中发现, 随着选育代数的增加, IGF-I基因上SNP位点的生长优势基因型的富集程度也增加了15。另外, IGF-IR作为育种的选择标记在美国农业部批准生产的沟鲶(Ictalurus punctatus)品种(USDA303)得到验证, 其快速生长品系肌肉中的IGF-IR的表达量(mRNA)比较慢生长品系高两倍以上16。肌肉生长抑制素(Myostatin, MSTN)基因具有肌肉发生负调控功能, 被誉为动物蛋白生产的重要基因。水产动物中也有多个物种的MSTN基因被分离出来, 如沟鲶、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、鲤(Cyprinus carpio)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)17-21, 但尚未见利用MSTN基因进行辅助选育的报道。利用与性别连锁的基因/标记进行单性苗种的生产, 是雌雄个体差别较大的水产动物的养殖业者追求的技术。因此, 鉴定性别相关基因/标记是水产遗传研究的重要目标之一, 但水产动物性别连锁基因/标记很难鉴定。II型生长激素可能是最早被鉴定与性别连锁的基因, 也已用在鲑和鳟的单性鱼苗的生产上9,22, 通过基因型分析剔除遗传上的真雄鱼, 完全用生理上的伪雄鱼与正常的雌鱼受精生产全雌鱼。青鳉(Oryzias latipes)Dmy/dmrt1bY是鉴定到的第一个决定鱼类性别的基因23,24, 其它鱼类的决定性别基因多数是以此为基础获得的。Mei等25介绍了在鱼类中雄性决定基因呈现出多样化的特征, 即使在同一属的鱼类中, 也有不同的性别决定基因。目前已发现多个鱼类雄性决定基因, 如gsdf(吕宋青鳉, O. luzonensis), sox3 (恒河青鳉, O. dancena), amhr2(红鳍东方鲀, Takifugu rubripes), Amhy(银汉鱼, Odontesthes hatcheri), sdY(虹鳟), dmrta2(斑马鱼, Danio rerio)。但Dmrt1是很多种鱼类的雄性决定基因, 包括青鳉、半滑舌鳎等。Mei等25总结有14种养殖鱼类雌性明显大于雄性, 如半滑舌鳎, 陈松林等26发现了多个与半滑舌鳎性别有关的基因, 其中包括决定雄性的Dmrt1基因; 有11种养殖鱼类雄性显著大于雌性, 如黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco), 已发现多个与黄颡鱼性别相关即决定雄性的候选基因27-29。虽然黄颡鱼性别相关标记已鉴定多年并应用于生产全雄鱼, 但黄颡鱼的性别决定基因和作用机制尚未完全阐明。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)也是雄性大于雌性的主要养殖鱼类, Li等30通过基因敲除、敲入可以精巧地控制性别, 并认为amhy/amhrII是较为重要的性别决定因子; Tao等31认为与先前已鉴定的性别基因(Foxl2, Cyp19a1a, Gsdf, Dmrt1, Amh)紧密连锁的还有Gtsf1, tesk1, Zar1, Cdn15和Rpl等基因; Wei等32认为Sox基因家族的很多成员参与了罗非鱼性别决定。石斑鱼(Epinephelus coioides)的特点是雌雄转化, Xia等33发现Dmrt1在性别转化中起重要作用, 认为无内含子Dmrt1可能是刺激雌雄同体性腺中精子发生的重要基因, 研究表明Sox3和Sox9等基因也参与了石斑鱼的性别分化。总之, 作为变温动物的鱼类性别决定机制极其复杂, 获得的相关基因也远多于哺乳类动物等性染色体已特化的物种。上述养殖鱼类的性别决定基因和性别决定机制的研究正处于深入发展阶段, 在各种组学技术快速发展的现阶段, 阐明几个物种的性别分化的生物学机制, 获得一些有突破性的结果是可以预期的。病害造成的损失是水产养殖业遇到的最大损失, 因此, 鉴定抗病相关基因的研究特别受重视。首先可以给鱼类抗病基因初步确定一个广泛的定义, 即在抵抗病原体入侵过程中起积极作用且有利于鱼类存活的基因。目前获得的鱼类抗病基因大致可分为三类, 一是免疫过程的基因如主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)通路上的基因; 二是动物通用的杀灭病原体的基因如抗菌肽(antimicrobial peptide)和干扰素(Interferon)等的基因; 三是针对特定病原体研究获得的相关基因。贾震虎等34分析硬骨鱼类MHC I由于具有多样性的多肽结合区PBR(pepetide-binding region)、基因结构的多态性和干扰素刺激应答元件ISRE(stimulatd response sequence), 推测其对抵抗病原体入侵中具有重要作用。目前, 国外获得了MHC I与抗病有关的物种有大西洋鳕鱼(Gadus morhua)和沟鲶35,36等, 而我国多是鉴定到MHC 与抗病力连锁, 如张玉喜等37发现了牙鲆(Paralichthys olivaceus)MHC 与抗病力有关; 徐建勇38发现MHC B与大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗病有关; 柴欣等39认为团头鲂(Megalobrama amblycephala)MHC 基因的多态性与抗细菌性败血症性状显著关联, 纯合基因型个体对嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病抗性更高。抗菌肽基因是克隆较早的基因之一, 1998年就克隆了鲶鱼的相关基因40, 近年来仍有很多关于鱼类抗菌肽基因克隆、遗传与生理机制的研究报道41。鱼类干扰素的研究开展的也较早42,43, 1998年报道了牙鲆干扰素基因的克隆44, 2017年国内仍有多篇干扰素的研究报道45-47, 表现出人们对用干扰素来防治疾病仍寄以很大希望。鱼类非特异性免疫相关基因的克隆与功能研究。鱼类和其他多数水产养殖动物后天免疫或者有缺陷或者研究不够, 至今没有获得如同哺乳类那么多的免疫球蛋白, 疫苗开发的也不够好, 因此, 人们更关注先天免疫。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是比较重要的先天免疫相关因子, 编码TLR的基因是一个很大的家族, 即TLR基因家族。Gong等48对鲤全基因组筛查结果显示, 鱼类的TLR基因家族较为庞大, 许多基因与哺乳类相同, 也有部分基因为鱼类特有, 这些特有的基因和基因的高度多态性, 允许研究者从中筛选出与抗病性相关的基因并用于抗病品种的选育。范泽军等49的综述也表明鱼类TLR基因的结构复杂、多态性较高。TLR基因同样受到我国研究者的重视, 红鳍红方鲀、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、虹鳟、大西洋鲑(Salmo salar)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、鲫(Carassius auratus)等多种鱼类已经克隆了TLR基因49, 最近仍有很多TLR家族基因被克隆的报道, 并开展了信号通路等功能研究, 包括鲤、赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)、瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)、尼罗罗非鱼等50-53。我国鱼类养殖成本的4060%是饲料成本, 提高饲料利用效率的经济价值巨大, 但是饲料转化相关基因的研究报道很少。从营养学角度探索提高饲料利用率的途径是很重要的方向, 但依据基因功能选择高饲料转化效率的品种也应该是一种策略。我国研究者开展了鲤饲料转化率与源于表达序列标签(expressed sequence tags, EST)的SSR标记的关联研究54,55; Lu等56获得了18个饲料转化率性状的候选基因, 其中IGF I也是鸡、牛和猪的饲料转化率显著相关的基因57,58; 张晓锋等59利用全基因组关联分析(genome-wide association studies, GWAS)获得了17个鲤饲料转化率的候选基因, 包括胰腺淀粉酶等。鱼类品质相关基因的研究。我国水产养殖产量已远大于捕捞产量, 一些大宗品种的产量已超出市场需求。应对这个产业实际和国家提出的“供给侧”改革政策, 淡水鱼类品质提升的品种改良被提到重要位置, 相关基因的鉴定和育种潜力研究也受到科学家的关注。鱼肉品质遗传改良的研究刚刚起步, 根据几篇综述60-62分析构成鱼肉品质的几个方面如物理、化学和组织学指标以及一些风味物质, 多数受营养、饲料和环境影响较大, 依据现阶段的研究结果可以从基因角度进行探索的指标包括肌间刺、肌纤维、脂肪酸及相关酶类、鲜味氨基酸、肌苷酸等。李远友等63,64克隆研究了多个鱼类的高度不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acid, HUFA)合成通路上的关键酶基因; 俞菊华及合作者65-67在脂肪酶合成方面对鲤的多个相关基因进行了克隆和研究; 吴景等68克隆了鲤脂肪酸延长酶的基因; 任晓亮等69鉴定到控制虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因, 孙玉华等70克隆了鲤、鲫和鲢(Hypophthalmichthys molitrix)的谷胱甘肽转移酶基因; Ji等71分析了茶多酚对大黄鱼脂肪代谢相关基因组表达的影响。鱼类品质相关基因克隆了很多, 用于品种选育的研究也正在进行, 但利用单个或几个基因育成品种未见报道。由于品质性状与基因的关系非常复杂, 利用基因及标记提高鱼类品质的选育确实是一个很大的也很有意义的挑战。窗体顶端窗体底端窗体顶端窗体底端1.3 经济性状连锁的标记与主效QTL目前, 获得水产动物与性状连锁或者决定性状的基因/标记主要有三种策略, 一是生物化学手段, 如用基因转录产物来鉴定目标基因, 1.2中介绍的基本上是使用这个技术路线; 二是分子数量遗传学方法, 包括连锁定位和关联分析尤其是GWAS; 三是候选基因法。遗传连锁分析是获得复杂性状以及未检测到生化产物的性状决定基因的重要手段, 人类基因组计划中特别强调连锁图谱的价值也在于此72。水产动物的经济性状多数是受多个微效基因控制的数量性状, 不易找到性状的决定基因; 很多质量性状也没有获得相关的生化产物, 难以利用生化手段获得目标基因。因此, 利用分子数量遗传学方法获得性状相关标记或基因是较为有效的途径, 即使质量性状和阈性状也可以用这种方法鉴定性状连锁的染色体区间进而鉴定相关基因。Laghari等73总结水产养殖动物已开展了体色等6个质量性状、体质量等21个数量性状和抗病等6个阈性状的遗传连锁分析。耐热可能是最早进行QTL研究的性状, 1998年Jackson等74用微卫星标记分析了3个虹鳟家系的耐热性状, 鉴定到2个微卫星标记与耐热相关。数量性状中研究最多的是生长性状, 虽然通过QTL研究最终会获得决定生长速度的基因, 但是一方面生长性状现阶段不是多数水产养殖种急迫需要改进的性状, 因为常规选育对生长的改良同样有效; 另一方面, 生长性状始终是选育品种必须要做好的性状, 因为这是与养殖效益密切相关的, 一般来讲, 没有好的生长性状的品种是很难被养殖户认可的, 除非有特别的市场需求。品质的提升和饲料转化率的提高都是我国淡水鱼类需要改进的性状, 与品质有关的脂肪含量连锁的QTL主要有大西洋鲑和鲤等的报道75-78; 饲料转化率前期报道较少, 主要是有关鲤的研究结果, 王宣朋等79鉴定到一批与镜鲤饲料转化率相关的QTL; Lu等56在比较镜鲤两个家系的QTL基础上利用全基因组资源, 并通过比较基因组鉴定到18个与生长和代谢有关的基因, 其中IGF I也是鸡、牛和猪的饲料转化率显著相关的基因; 2017年Pang等80报道了鲫饲料转化率的QTL结果。抗病性状具有较好的应用前景, 我国水产养殖中鱼、虾病害比较严重, 给产业造成了极大的损失, 药物治疗和疫苗防治虽然都非常有效, 但培育抗病品种也是一种有效途径。日本东京海洋大学的Okamoto团队在抗病性状的QTL研究中成果突出, 他们对虹鳟、香鱼(Plecoglossus altivelis)、牙鲆等81,82抗病性状进行遗传定位, 再用定位的标记进行品种选育, 获得了养殖水平的抗病品种。王志勇2认为该团队成功的关键是在研究中分别建立了抗病品系和易感病品系的雌核发育纯系, 通过两者杂交再回交获得的子代抗病性能发生分离, 使鉴定到的标记位点更为真实、准确。我国学者在鱼类抗病QTL方面也做了大量研究, 如Xu等83鉴定了牙鲆抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)病的QTL位点, 贺艳84对美洲牡蛎(Crassostrea virginica)抗病性状进行了QTL等分析。QTL研究有一个明显的不足是家系间共享的主效QTL比较少, 这将限制其在选育种中的应用, 例如Zheng等85在4个镜鲤家系定位到的67个生长相关的主效QTL中, 未发现个家系共享的QTL, 仅发现1个为3个家系共享, 14个为2个家系间共享, 多数主效基因在另一个家系中是微效甚至无效的。更为严重的是在同一个群体的不同发育阶段, 主效QTL的差异也很大, 譬如, Gutierrez等86发现大西洋鲑的5个家系在10、21、27、38月龄样本的体重主效QTL数量上差异很大(分别为26个、14个、21个、17个), 这个团队将上述279个样本混合并加入192个新样本做GWAS分析, 与生长显著相关的SNP只有1个, 研究者认为混合样本中某些家系贡献小的等位基因稀释了其他家系该基因的显著效应87。利用候选基因法获得基因是水产动物获得性状相关基因的重要途径, 由于这类标记积累的越来越多, 其应用价值也将越来越大。这类基因标记有两个来源, 一是同物种已鉴定的候选基因, 二是不同物种同一性状的候选基因, 这在先前的研究中已有很多例子, 譬如李小慧等88利用候选基因法获得了与大口黑鲈生长紧密连锁的基因标记。1.4 经济性状的全基因组关联分析在高通量分析技术出现之前, 利用中等密度的图谱获得的QTL常被认为因精度不够而降低了准确性, 群体间共享QTL少也多认为是因标记数量不足或样本过少而影响了重复度, 科学家们希望高通量的标记可以解决这个难题。但是, 在进行了一些GWAS分析后, 发现群体间共享标记少的现象仍然存在, 人身高的GWAS结果提供了这样的案例, 如2010年欧洲人身高的第一个GWAS结果, 获得180个位点和相关的17个通路89; 2014年, Wood等90利用25万个样本较先前利用13万个样本所鉴定到的紧密连锁位点的数量提高3倍多(从180个到697个), 相关的通路也增加近3倍(从17个到50个), 表明与身高连锁的基因和所在通路与样本的遗传背景相关性非常大; 又如Lei等91通过全基因组关联分析发现了13个与汉族人群身高显著相关的SNP位点, 但在欧洲人群中却不显著。以上研究结果表明GWAS与QTL相似, 群体遗传背景对结果的影响非常大。GWAS具有标记多可以全基因组范围仔细筛查与性状相关变异位点的优点92, 因此, 更容易获得基因所在区域, 也就更有可能获得决定性状的基因。因此, 该方法出现后, 尤其是在二代测序技术使测序费用大幅降低后, 很多生物学领域包括世界上投入基础研究较少的水产动物遗传育种领域也很快开展了研究, 如刘占江、孙效文和Houston等所在团队分别建立了沟鲶、鲤和大西洋鲑的高通量SNP芯片作为开展GWAS研究的平台93-95。由于测序价格下降, 利用重测序开展GWAS分析可能是一个很实用的技术路线, Wan等96用GWAS分析了大黄鱼n-3 HUFA和空壳重性状; Xu等97对雅罗鱼(Leuciscus waleckii)的淡水种和耐高碱水种进行了比较分析, 鉴定到一大批参与离子稳态、酸碱调节等高碱水适应变化有关的基因; Lamichhaney等98对大西洋和波罗的海不同区域的鲱群体进行重测序, 判断出大西洋鲱(Clupea harengus)不同群体的遗传分化主要来自各大地理群的地理适应; Hohenlohe等99利用GWAS结果和先前鉴定的基因位点发现了鳟鱼杂交群体具有来自候选的适应性超入侵等位基因; 李雪100利用GWAS筛查了与虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)类胡萝卜素积累相关的基因和SNP位点, 利用GWAS鉴定水产养殖动物经济性状相关基因的研究还有很多。自GWAS出现以来, 相关的技术创新也很多, 其中我国科学家在这个学科的发展中做出了重要贡献, 如Wang等101建立了基于2b-RAD高通量测序的基因型分型技术, 不仅文章被广泛引用, 其研究方法也被国内外很多研究者使用。2 水产动物分子标记辅助育种的研究进展水产动物利用分子标记开展育种研究早在同工酶分析技术时代就有报道102, 但广泛开展分子标记辅助育种是在出现DNA分子标记之后, 尤其是鉴定到足够的共显性分子标记之后才开始的。2.1 国外水产动物分子标记辅助育种研究进展日本东京海洋大学Okamoto团队设计了一个非常有效的分子育种战略: 首先利用合作单位获得的对病原体的1个敏感品系和1个抗病品系建立杂交家系, 进而与敏感家系或抗病家系回交作为QTL分析家系, 开展抗病性状的QTL分析鉴定抗性位点, 然后检测出抗病位点的纯合基因型个体作为亲本, 与生长快的品系杂交, 得到了几乎不染病的新品系。该团队及合作者利用这个育种策略获得了牙鲆、虹鳟和香鱼抗病力强的具有生产规模的品系103-105, 这项工作被誉为水产分子标记辅助育种成功的范例。利用基因/标记开展选育的报道很多, 如Azis等106利用沟鲶具有抗嗜水气单胞菌特征的MHC I基因型开展了抗病品系的选育; Sae-Lim等107将虹鳟的生长、胴体重和存活率等性状综合在一起进行选育; Kobayashi等108依据基因型分析选育了卵径大、产卵早的虹鳟品系; Correa等109基于QTL定位结果开展了大西洋鲑抗海虱(Caligus rogercresseyi)新品系的选育; 在国外, 利用基因/标记的选育工作还涉及很多物种和很多性状110-112, 这里不再一一介绍。用少数基因/标记获得突破性的育种结果很困难, 人们寄希望于全基因组水平的标记, 因此, 全基因组选择育种成为近年来养殖动物的研究热点。这项技术是挪威科学家Meuwissen在2001年113提出的基于基因组水平的遗传信息的育种方法, 该文章发表后其技术被广泛地用于农业动植物育种研究, 至目前已被引用1500多次。这项技术用在奶牛育种中取得了使产奶量大增的突破性进展, 但是其他性状进展不是特别明显。正如Meuwissen等114,115的几篇综述中所表明的, 这项技术在多个性状选育中都具有正效应, 应用潜力巨大, 但仍存在数量处理难度大、遗传增益较小等问题。国外已有多个水产动物开展了基因组选择育种, Vallejo等116报道对于虹鳟冷水疾病的抗性, 基因组选择效率高于最佳线性无偏预测(best linear unbiased prediction, BLUP)方法; Houston等117报道正在用全基因组选择开展鲑鱼的寄生虫和其他多种病原体抗性的遗传改良。Abdelrahman等118的综述认为, 美国的主要养殖对象沟鲶、虹鳟、大西洋鲑和罗非鱼的基因组资源已非常丰富, 但只有虹鳟和大西洋鲑开展了全基因组选择育种, 其他物种正在开展这项育种研究。虽然基因/标记辅助育种和基因组选择育种已广泛开展, 但是杂交、三倍体操作等传统动摇育种对象遗传基础的技术仍然是获得新性状的主要技术, 即使在基因组时代这些技术仍然很重要, 也在广泛应用, 譬如Dunham等119利用沟鲶与蓝鲶(Ictalurus furcatus)杂交来提高抗病力和生长速度; Chatchaiphan等120获得了三倍体大头胡鲶(Clarias macrocephalus)。2.2 国内水产动物分子标记辅助育种研究进展在过去的十年, 中国水产动物的分子标记辅助育种已广泛开展, 大多数养殖种的选育都不同程度地使用了基因和标记, 有的用在了种质创建阶段, 有的用在了品种选育阶段。根据孙效文在鱼类分子育种学2中对鱼类分子育种的定义, 在群体、家系或个体选择中全部或者部分使用了基因和标记都属分子育种范畴。国内水产动物分子标记辅助育种主要集中在抗病、生长和品质等性状, 但至今为止, 还没有育种效果明显好于常规育种的实例。那些常规育种难以选育的性状如肌肉品质、肌间刺等的选育还处于研究阶段。抗病育种的报道很多, 如桂建芳等培育出银鲫中科5号121, 其具有适应低蛋白饲料和高抗病力的优点; 陈松林团队利用分子标记辅助育种技术分别培育了牙鲆生长快的品系和对爱德华氏菌抗病力高的品系122, 并利用这两个品系的杂交培育出既生长快又抗病力强的杂交品种“鲆优2号”123; 孔杰团队在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)都培育出抗病品种并获得应用(黄海2号、海兴农2号)。还有很多利用基因/标记的抗病品种培育处于研究之中, 如Jia等124获得对鲤疱疹病毒(CyHV-3)高成活率的新品系。总之, 虽然分子标记辅助抗病育种仍有非常多的研究工作需要开展, 但是抗病育种结果已应用到产业, 并取得了较好的选育效果。生长性状相关基因的标记也已经用到品种选育中, 如孙效文等125利用镜鲤体重相关的QTL结果建立了镜鲤的新品系; 徐磊等15检测到生长优势基因型在大口黑鲈选育过程中逐代增加; 包振民等126将高产和抗逆结合在一起用于扇贝品种选育。国内也开展了很多基因组选择育种的研究工作, 如包振民团队127利用所建立的全基因组选择技术培育出生长快、抗逆强的“海益丰12”(GS-01-006-2016); 陈松林团队128和王志勇团队129分别开展了半滑舌鳎和大黄鱼的全基因组选择育种; 根据学术讨论会上的报告, 国内还有很多基因组选择育种的研究在进行之中, 未来会有较好的育种结果应用在产业上。3 水产动物分子标记辅助育种的技术与理论讨论3.1 水产动物标记辅助育种技术孙效文等2建立了利用中性标记开展分子标记辅助育种的技术, 主要利用标记控制亲本的近交和远交。根据该课题组的结果, 多数两性生殖鱼类, 过度的近交和过度的远交都不利于优良性状的形成和遗传。该技术结合我国淡水鱼类常用的两种选育技术家系选育和群体选育, 建立了分子标记指导的家系选育和分子标记指导的群体选育, 选育过程仍以表型选择为主同时增加了标记计算的亲本间的遗传距离用于繁殖配组, 杜绝了过度近交和过度远交, 这项技术也申请了专利, 并为我国十几个育种单位使用。图1为标记指导选育的操作方案示意图。这项技术基本上解决了美国农业部当初提出水产基因组计划时要解决的主要技术问题130: 鱼类由于子代出生时个体太小, 无法进行物理标记而不得不先分池饲养, 待长大后再标记、同池饲养。这个难题阻碍了在畜禽中应用良好的家系选育技术在水产动物中的应用。基础群体(筛选)screening basic population表型选择phenotypic selection基因型选择genotypic selection优良群体(近交系数低)excellent group with low inbreeding coefficient 子代的低龄期表型选择phenotypic selection of offspring at the younger age表型测定phenotypic measurementphenotypic measurement基因测定genotypic detection确定亲本confirm parent配组繁殖reproduction多代重复, 直至培育出新品种It is until to develop new varieties through repeat generations selection.新品种new varieties定型character determination 图1 鲤分子标记指导的群体选育技术示意图Fig. 1 Schematic drawing of marker-based mass selection for common carp目前应用更多的是基于性状连锁的标记建立的育种技术, 主要包括抗病、性别控制等育种技术方案。在抗病方面, 陈松林等131利用MHC基因标记建立了牙鲆抗病育种技术; 贾智英等132建立了鲤鱼抗病家系的选育方法。在性别控制方面, 刘汉勤等133,134利用性别相关的分子标记建立了全雄黄颡鱼的制备方法; 陈松林等135-137基于性别相关基因和标记建立了多种高雌性半滑舌鳎的生产技术; 李恒德等138发现新的性别转化调控机制, 并在生产高雌性比的半滑舌鳎苗种中获得了利用139; 王德寿等140开发了罗非鱼性别调控技术并用于超雄鱼的制备; 包振民等126,141在阐述扇贝闭壳肌颜色和抗逆等性状分子机制的同时, 建立了相应的育种技术。全基因组选择育种技术是近年来讨论最多的新型育种技术, 人们更重视全基因组选择育种技术的原因有两个, 一是在认识上认为利用性状连锁的标记越多育种效果也应该越好; 二是QTL用于品种选育尚未得到预期的结果, 促使人们寄希望于全基因组选择。如前所述, 我国和世界发达国家一样也非常重视这项技术, 如陈松林等142建立了一种基于全基因组选择的鱼类抗病技术, 包振民团队127,143,144建立了基于全基因组分型技术的贝类选择育种技术, 王志勇团队145,146建立了大黄鱼基因组选择育种研究方案等。相对于农业作物和动物, 水产动物分子标记辅助育种和全基因组选择育种研究开展的较晚, 选择代数较少。但水产育种的历史表明, 使用过的育种技术如杂交育种、系统选择等, 只要坚持下来总会取得良好的育种效果。同理, 分子标记辅助育种和全基因组选择育种, 不管用到什么物种上, 只要坚持多数会得到比较好的育种结果。但是目前大部分分子标记辅助育种和基因组选择育种的效果并没有明显好于传统育种技术, 究其原因可能有以下几点, 一是尽管在选育中使用了性状连锁基因相关的标记, 但由于基因与性状的关系过于复杂, 我们选择的标记只是性状连锁的一部分, 基因组背景变化后所选基因或标记可能就不能代表决定性状的关键基因了, 因此, 虽然使用了标记, 但标记价值不大时, 还是以表型选择结果为主; 二是产业已有大量的新品种了, 再选出的品种对都不会有最初的品种对产业进步那么高的价值了; 三是使用育种群体不够大或者家系不够多, 分子标记和全基因组选择也要求有大量群体或者大量家系作为多样性保障, 国内育种使用的家系数量少或者群体不够大是目前普遍存在的不足, 根据群体遗传学理论和育种实践, 育种群体越大效果越好, 这个在常规选育中的“金科玉律”在分子标记辅助育种中也是普遍适用的。3.2 水产动物分子标记辅助育种理论讨论水产动物分子标记辅助育种已经开展有十几年的时间了, 但理论还不成熟, 孙效文等在鱼类分子育种学中讨论了相关的理论基础, 即生物学的基本法则是遗传信息从DNA传向RNA, 从RNA传向蛋白质, 蛋白质与环境相互作用决定性状, 或者说, 分子标记辅助育种的理论基础就是性状是由基因决定。因此, 利用DNA分子标记建立育种技术是表型选择有效的遗传基础, 是育种技术发展的必然方向。对优势基因或标记的富集, 结合传统育种技术和物种生物学特性, 再结合分子标记检测的个体与群体的遗传组成, 将上述遗传与表型数据经现代生物统计方法进行处理可以建立选择强度大效果好的鱼类育种技术, 即以基因和标记为核心的鱼类分子标记辅助育种技术。此技术理论的核心要素: (1)表型选择仍是获得好的经济性状有效步骤, 但基因型选择是建立优良种群的决定性步骤; (2)性状的优势基因型的富集是获得优良性状的遗传基础, 依据群体或家系QTL等分析结果, 可以通过标记检测和选择达到富集家系或群体内的优势基因型的目的; (3)避免近亲繁殖是建立优良品种和进一步保护品种优良性状的关键环节, 利用共显性分子标记可以准确检测群体或家系个体间的亲缘关系, 从而将群体内或家系内的近交系数降到最低; (4)基因与综合性状的指数评估是将基因和标记融入育种技术的关键, 优势基因和标记要通过群体并形成品种来体现其优势, 将基因和标记及其他性状都利用指数来评估是建立优良种群所必需, 包括基因和标记对性状的贡献值的综合指数的BLUP分析或其他统计分析可以实现这个目标。分子育种具有不同的发展阶段, 鉴于性状是由基因决定的, 笔者相信, 在今后相当长的历史阶段中, 鱼类分子育种研究将一直围绕如何利用基因与性状的关系而不断地发展出有效的育种技术。目前是分子育种技术发展的初级阶段, 刚刚鉴定到一些与性状连锁的基因和标记, 对基因如何决定性状、对鱼类生存的外环境和基因所在基因组的内环境是如何影响基因的转录与表达并最终决定性状的优劣等过程还知之甚少, 基因与性状的复杂关系的解析是一个相当长的研究过程, 以此为基础的分子育种技术也有一个相当长的发展过程。由此, 鱼类分子育种技术具有发展阶段论的特征。4 推荐一个实用的分子标记辅助育种技术目前基因组选择育种技术正在被广泛使用, 尤其是承担各级政府资助的项目需要选育过程有较高的技术含量, 很容易选用基因组选择育种技术作为主要技术内容, 但又遇到成本高和工作量大两大问题。针对这样的难题, 笔者推荐一个既包含全基因组选择内容又包含大规模家系育种材料的技术方案。众所周知, 挪威在大西洋鲑选育中所用的家系选育技术非常实用, 其中一条就是利用几百个野生群体构建了最初的几百个家系, 且每一代都用了200个家系以上的育种材料。这里包含的育种经验就是家系越多, 获得优良家系的可能性越大。笔者推荐一个建立超大规模混合群体并从中鉴定优良家系的技术, 简介如下: 我们将3.1中的分子标记辅助选育技术用于500个家系的混合群体分析, 利用“优选法”理念, 依据目标性状在1龄和2龄两个阶段进行选育, 获得目标性状的优良个体组成候选后备亲鱼群体, 进而用分子标记对后备亲鱼群体进行家系鉴别, 从而解决了超大混合群体中鉴别优良家系的技术难题。在此可以对所选后备亲本进行全基因组测序, 依据参考群体目标性状优势基因型鉴别出最优基因型组合的雌雄个体作为下一代繁育的配组亲本。在前期的研究中, 从30多万个混