生物化学ppt课件 RNA生物合成.ppt

第十三章 RNA生物合成CHAPTER 13 RNA BIOSYNTHESIS,2,本章主要内容,转录作用（Transcription）转录作用及其特点 RNA聚合酶（原核和真核生物RNA聚合酶）DNA模板（启动子和终止子）转录过程（起始、链的延长和终止）,转录后的加工过程（Post-transcriptional processing of RNAs）mRNA前体的加工 tRNA前体的加工 rRNA前体的加工,RNA的复制（RNA replication）,核酶（Ribozymes）,3,DNA vs.RNA,4,rRNAs(ribosomal RNAs)75-80%：以核蛋白体的形式参与蛋白质生物合成，是蛋白质合成的场所tRNAs（transfer RNAs)10-25%：在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸mRNAs(messenger RNAs)2-3%：作为蛋白质合成的直接模板hnRNAs（heterogeneous nuclear RNAs）mRNA的未成熟前体snRNAs（small nuclear RNAs）参与mRNA前体剪接过程non-coding RNA,RNA种类及作用,6,第一节 转录作用Section 1 Transcription,转录作用（DNA-dependent RNA synthesis）,Transcription,在RNA聚合酶催化下，以DNA为模板，以4种三磷酸核苷（ATP,GTP,CTP,UTP）为原料进行的RNA聚合反应,7,转录作用的特点（Characteristics of Transcription）,部位：细胞核内 DNA A G C T 碱基配对规律:RNA U C G A RNA核苷酸连接方式：3,5-磷酸二酯键 方向：53，合成过程是连续的，不需引物 方式：不对称转录（asymmetric transcription）,8,DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称为不对称转录,不对称转录（asymmetric transcription）,9,transcription,5TCAGCTCGCTGCTAATGGCC33AGTCGAGCGACGATTACCGG5,模板链（template strand）编码链（coding strand）,Double strand of DNA,10,编码链和模板链是一个相对的概念,11,参与转录的物质,原料:NTP(ATP,GTP,CTP,UTP)模板:DNA的一条链酶:RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol)无机离子：Mg2，Mn2其他蛋白质因子,12,二 RNA聚合酶 RNA polymerase,13,核心酶（core enzyme）,全酶（holoenzyme）,（一）原核生物RNA聚合酶,结构:,2,2,14,36512,决定哪些基因被转录,150618,催化RNA链延伸,155613,结合,DNA,模板,70263,辨认起始点（转录起始后脱落）,亚,基,分,子,量,功 能,11000,功能不明,亚基数,2,1,1,1,1,原核RNA 聚合酶各亚基的作用,15,1.辨别转录起始点 2.促使DNA双链打开17bp 3.催化NTP以3,5磷酸二酯键相连，方向53 4.识别转录终止信号,原核RNA聚合酶的功能,16,原核RNA聚合酶作用特点：,1.聚合速率慢，3085 nt/s（DNA合成250-1000nt/s）,2.缺乏3 5外切酶活性，无校对功能，错误率高（10-4 10-5，DNA合成错误率10-9 10-10）,3.活性可被利福霉素，利福平抑制（与亚基结合）,利福平抗结核的机理,17,（二）真核生物RNA聚合酶,种类,II,III,5.8S/18S/28S rRNA前体,hnRNAU1,U2,U4U5 snRNA前体,转录产物,I,Mt,定位,核仁,核质,核质,线粒体,tRNA前体5S rRNA前体U6snRNA前体,线粒体 RNA,利福平 不敏感 不敏感 不敏感 敏感,利福霉素 敏感 敏感 敏感,18,三 模板DNA结构特点 Structural characteristics of DNA template,转录起始点(start site)以+1表示，一般为A或G,上游(upstream):基因调控区(启动子、增强子、静息子)下游(down stream):基因转录区（结构基因、终止子）,19,RNA-pol Protection Assay,20,启动子（promoter）：位于转录起始点上游的一段核苷酸序列，是 RNA聚合酶识别并结合模板DNA的特定部位,21,原核生物启动子保守序列,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,RNA-pol 结合位点(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,RNA-pol 识别位点(recognition site),5,5,结构基因,3,3,RNA-pol,22,真核生物启动子保守序列,23,四 转录过程 Transcription Process,转录过程可以分为三个阶段：,1.转录起始（Initiation）2.转录延长（Elongation）3.转录终止（Termination）,（一）原核生物的转录过程（二）真核生物的转录过程,24,1.转录起始（Initiation）,RNA聚合酶必须准确结合转录模板的起始区域DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板,（一）原核生物的转录过程,?,转录起始需解决两个问题,RNA聚合酶-识别DNA启动子(35区),核心酶与启动子结合(10区),DNA构象改变，启动子10区处打开双链DNA分子（约17bp),转录起始过程,DNA构象改变，启动子10区处打开双链DNA分子（约17bp),转录开始，形成第一个3,5磷酸二酯键（不需引物）,核心酶沿模板向下游移动,（循环使用）,27,核心酶沿DNA模板链向下游方向滑动,核心酶滑过的部位，DNA链很快恢复双螺旋结构,RNA链延长，暂时形成DNARNA杂交体（约8bp）,RNA逐步脱离模板链,2.转录延长（Elongation）,28,转录泡(transcription bubble)由DNA双链（打开约17bp）,RNA聚合酶与新合成的RNA链局部形成的结构.,29,原核生物转录过程中的羽毛状现象,30,3.转录终止（Termination）,核心酶遇到DNA模板的终止信号和或因子,阻碍核心酶继续滑动,核心酶从模板DNA上脱落,新合成的RNA链脱落，转录终止,31,终止信号（stop signal）：在基因单位中，具有停止转录作用的部位,包括GC富集区和AT富集区,也称终止子。,依赖因子的转录终止 非依赖因子的转录终止,原核转录终止方式：,(terminator),32,1.依赖Rho因子的转录终止,辅助识别终止信号诱使RNA聚合酶构象改变 具有解螺旋酶活性，释放RNA产物,因子（6聚体蛋白质）：,33,34,2.非依赖Rho因子的转录终止,终止信号处有特殊的碱基序列:GC富集区和AT富集区，使转录生成的RNA形成发卡结构和多聚U序列，促使转录终止。,原核生物转录过程,37,（二）真核生物的转录过程,1.转录起始（Initiation）,起始过程比原核生物复杂,上游调控序列复杂启动子Promoter增强子Enhancer、静息子Silencer等,RNA聚合酶不直接与模板结合转录前起始复合物 pre-initiation complex,PIC 需多种转录因子参与,38,转录起始点上游区段,39,真核生物转录前起始复合物pre-initiation complex,PIC,TF：与RNA聚合酶结合的转录因子,40,2.转录延长（Elongation）,真核生物RNA-pol前移会遇上核小体,41,和转录后修饰密切相关,3.转录终止（Termination）,转录终止修饰点,AATAAA.GTGTGT,（编码链）,GUGUGU,42,第二节 转录后的加工过程Section2 RNA Processing,剪切(cleavage)和剪接(splicing)末端添加(terminal addition)核苷酸化学修饰(modification)RNA编辑(RNA editing),将转录生成的前体RNA转变为成熟的、有活性的RNA的过程,主要加工方式：,43,剪接(splicing),剪切(cleavage),44,一 mRNA前体的加工,（一）mRNA生成特点,Processing of mRNAs Precursor,原核生物：多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)没有核膜，转录和翻译同时进行 不需复杂加工就表现出生物活性真核生物：单顺反子mRNA(monocistronic mRNA)直接转录生成mRNA前体hnRNA 需要在细胞核加工成成熟的mRNA,45,Polycistronic mRNA,原核生物,多顺反子mRNA,Monocistronic mRNA,真核生物,单顺反子mRNA,46,5末端加帽(5 cap)3末端加尾去除内含子，连接外显子甲基化修饰核苷酸编辑,（二）真核生物mRNA前体的加工,(3 polyA tail),47,5末端帽子的结构:m7GpppNmp-,7甲基鸟嘌呤 7methyl guanylate 5 5的连接 5 to 5 linkage 核糖2位羟基甲基化 methylation of 2 carbon,48,5 pppNp,5 GpppNp,pppG,ppi,鸟苷酸转移酶,5 m7GpppNmp,甲基转移酶,CH3-,5 ppNp,磷酸酶,Pi,5末端帽子的生成:,G/A,CH3,49,5末端帽子的功能:m7GpppNmp-,保护新合成的mRNA免被降解增加翻译活性协助mRNA转移至胞浆参与第一个内含子的剪接,50,3末端多聚A“尾”的生成,3 polyadenylation,G-T rich,转录终止修饰点,51,3末端加多聚A“尾”：,增加mRNA的稳定性加强翻译活性参与最后一个内含子的剪接,功能：,52,剪接作用（mRNA splicing）,53,剪接作用（mRNA splicing）,即在细胞核内,剪切hnRNA中内含子序列,将各外显子序列连接为成熟mRNA的过程,54,55,套索(lariat)的形成及剪除,56,剪接体的生成,（Formation of spliceosome）,在酵母和人体的mRNA剪接过程中，发现有剪接体的存在,57,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后加工,58,一个相同的初级转录本，在不同组织中由于剪接作用的差异，可产生不同编码的mRNA，导致翻译生成不同的蛋白质产物,可变剪接（Alternate splicing of mRNA）,意义：在组织特异性（tissue specificity）中发挥重要作用,59,Alternative processing of the calcitonin gene transcript,60,甲基化作用（Methylation）,甲基化位点,真核生物mRNA分子中含甲基化核苷酸 hnRNA 5端帽子结构 非编码区分子含12个m6A,需供体SAM和甲基转移酶参与,61,RNA编辑（RNA editing）,遗传信息在转录水平发生改变，由一个基因产生不止一种蛋白质,核苷酸残基插入、删除或替换,C,脱氨,U,62,二 tRNA前体的加工,Processing of tRNAs Precursor,剪接和剪切3末端添加-CCA碱基修饰,63,剪切（cleavage）RNase P切除5端多余的核苷酸 RNase D切除3端多余的核苷酸,剪接（splicing）:去除内含子序列,64,3末端添加-CCA,核苷酸转移酶,ATP,ADP,65,碱基修饰,66,三 rRNA前体的加工,Processing of rRNAs Precursor,剪接甲基化修饰,rRNA基因多拷贝，串联在DNA分子中,细菌：5-10 拷贝果蝇：260 拷贝 人：1100 拷贝,67,Prokaryonic 30S rRNA precursor,P16S,P23S,P5S,Pt,Pt,5,3,RNase,RNase,rRNA,rRNA,rRNA,tRNA,tRNA,(一)原核核糖体RNA的加工,68,(二)真核核糖体RNA的加工,69,第三节 核 酶Section3 RIBOZYMES,具有催化活性的RNA,核酶 ribozyme,核糖核酸酶 RNase,水解核糖核酸链,70,T.Cech等首先发现四膜虫rRNA前体具有自我剪接作用(1982),核酶的发现,S.Altman发现RNaseP中的RNA可催化tRNA的加工(1983),1989年诺贝尔化学奖,71,核酶类型,剪切型 催化自身RNA或异体RNA分子剪去一段 多核苷酸片段，功能类似于内切核酸酶,剪接型 切去自身RNA内部一段多核苷酸片段，再将剩余的两个片段连接，功能类似于内切核酸酶与连接酶的联合作用,其他类型,四膜虫rRNA的自我剪接,73,L-19 IVS 的功能：,核苷酸转移反应（核苷酸转移酶）水解反应（磷酸二酯酶）磷酸转移反应（磷酸转移酶）脱磷酸反应（酸性磷酸酶）RNA限制性内切反应（RNA限制性内切酶）RNA聚合反应（RNA聚合酶）,(linear-19 intervening sequence),74,核酶研究的意义:,核酶的发现，对生命起源的讨论提供了依据核酶的发现是对传统酶学的挑战利用核酶的结构设计合成人工核酶,An RNA world?,75,RIBOZYME clinical trials in progress:anti-HIV anti-cancer,76,某些生物（如RNA噬菌体和动物病毒）携带单链RNA基因组信息，进入宿主细胞后，以自身RNA为模板，4种NTP为底物，由RNA复制酶催化合成RNA。,第四节 RNA的复制Section 4 RNA Replication,RNA复制酶(RNA replicase)RNA指导的RNA聚合酶（RNA directed RNA polymerase，RDRP),77,附 录,78,转录和复制的比较,79,不同聚合酶的比较,80,真核生物与原核生物转录特点的比较,原核生物 真核生物,模板DNA 启动子 启动子增强子静息子,RNA聚合酶 1种，2 4种，pol,pol,pol，Mt,转录起始,RNA聚合酶以转录前起始复合物形式与启动子结合,因子识别启动子,RNA聚合酶直接与启动子结合,转录延长,核心酶沿模板向3端滑动,转录后加工 不需要复杂加工 需要剪接,末端添加,修饰,编辑等,聚合酶前行需核小体移位和解聚,81,本章重点,转录体系 模板、原料、方向、方式、RNA聚合酶（原核、真核）,转录过程 原核：起始、延长、终止 真核：起始、延长、终止,转录后加工 mRNA，tRNA，rRNA加工,核酶 四膜虫rRNA前体的加工,82,基本概念 不对称转录 asymmetric transcription 模板链 template strand 编码链 coding strand 启动子 promoter 外显子 exon 内含子 intron 转录泡 transcription bubble 单顺反子 monocistronic mRNA 多顺反子 polycistronic mRNA,