针对未折叠蛋白反应白想治疗多发性骨髓瘤课件.ppt
针对未折叠蛋白反应靶向治疗多发性骨髓瘤,侯健全军骨髓瘤与淋巴瘤中心第二军医大学长征医院 血液科,内质网应激与未折叠蛋白反应,内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器。有很多物理、化学可导致内质网功能的内稳态失衡,形成内质网应激(ER)内质网应激表现为 腔内错误折叠与未 折叠蛋白聚集以及 Ca2+平衡紊乱。而当错误折叠的蛋白质累积时,细胞通过多条信号转导途径,启动一系列基因的表达，对其进行适应性应答,这些反应称为未折叠蛋白质反应(UPR),内质网应激，未折叠蛋白反应及细胞命运,CHOP通路：是一个TF，在ER应激的ATF6和PERK通路中被诱导表达IRE1/TRAF2/ASK1/caspase12通路Ca2+通路,未折叠蛋白反应包括增强蛋白质折叠能力、停滞大多数蛋白质的翻译、加速蛋白质的降解等.如果内质网功能紊乱持续,细胞将最终启动凋亡程序.,未折叠蛋白反应通过四种机制缓解内质网应激,减少蛋白合成，防止未折叠蛋白的积聚。(停产整顿)诱导内质网伴侣分子，增强蛋白质折叠能力。（弥补过失）诱导内质网相关的蛋白降解，加速错误折叠蛋白降解。（清除影响）诱导凋亡，清除内质网应激中受损细胞（找替罪羊）,4,细胞处理未折叠蛋白的途径,E1:泛素激活酶 E2:泛素结合酶E3:泛素连接酶,Toru Hosoi and Koichiro Ozawa/Clinical Science(2010)118,1929,6,未折叠蛋白反应传感器及信号转导,骨髓瘤细胞的软肋,骨髓瘤患者血清M蛋白可以超过100g/L(甲胎蛋白是以g/L为单位的)骨髓瘤细胞含有丰富的内质网，每分钟可以分泌10000至80000个M蛋白分子其中1/4至1/3可能发生错误折叠未折叠或错误折叠的蛋白可以导致骨髓瘤细胞凋亡骨髓瘤细胞未折叠蛋白反应处于激活状态,未折叠蛋白反应：治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点,真核起始因子2(eIF2)磷酸酶抑制剂Cancer Res.2009;69(4):1545-52.肌醇需求激酶1(IRE1)抑制剂Blood.2011;117(4):1311-4.热休克蛋白(HSP)抑制剂SAHA组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂:vorinstat and Panobinostat(Phase III trial)第二代蛋白酶体抑制剂:carfizomib and NPI-0052PERK抑制剂和GRP-78抑制剂一石二鸟：联合治疗,我们的初步探索,2-甲氧基雌二醇三氧化二砷衣霉素和二硫苏糖醇 过氧化物酶体增殖激活受体（PPRA）配体,2-甲氧基雌二醇（2ME2）,雌二醇生理代谢产物，在孕妇尿液中大量存在诱导包括骨髓瘤在内的多种肿瘤细胞凋亡,低剂量2ME2作用72H后CZ-1细胞的形态学改变（1000）,对照组,0.5m,0.1m,0.5mol/L 2ME2作用72h后，LP-1，NCI-H929及CD138(+)骨髓瘤细胞的形态转变,LP-1,NCI-H929,原代骨髓瘤细胞,对照组,0.5mol/L,0.5mol/L 2ME2对骨髓瘤细胞形态的影响,对照组,36h,72h,不同浓度2ME2对CD49e表达的影响,2-ME2作用时间对骨髓瘤细胞分泌轻链蛋白量的影响,0.5mol/L 2ME2对 XBP-1 m-RNA 表达的影响,CZ-1,LP-1,NCI-H929,0h,36h,72h,72h,36h,72h,36h,0h,0h,0.5m 2ME2 对XBP-1 蛋白表达的影响,CZ-1,LP-1,NCI-H929,0h,36h,72h,72h,36h,72h,36h,0h,0h,2-甲氧基雌二醇（2ME2）,低剂量2ME2可以诱导骨髓瘤细胞分化形态免疫表型分泌功能其机制与B细胞生理性分化以及UPR的共同信号途径XBP-1有关,XBP-1 转录因子,浆细胞成熟,未折叠蛋白反应,B细胞,UPR诱导剂,调整UPR相关的基因 死亡 生存,骨髓瘤细胞,分化,?,?,XBP-1:未折叠蛋白反应浆细胞分化的交汇点,衣霉素和二硫苏糖醇,UPR诱导剂促进骨髓瘤细胞的分化,UPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化形态学改变(400),Control,Primary cell,U266,RPMI-8226,TM 0.4M 72h,DTT 0.5mM 72h,UPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e的表达,U266细胞对照,U266细胞处理48h,U266细胞处理72h,RPMI-8226 对照,RPMI-8226 48h,RPMI-8226 72h,UPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e表达,衣霉素对骨髓瘤细胞CD49e表达上调,二硫苏糖醇对骨髓瘤细胞CD49e表达上调,衣霉素处理,二硫苏糖醇处理,UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度,UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度,UPR诱导剂上调GRP78,GRP94的表达,UPR诱导剂上调XBP-1u,下调XBP-1s,Real time RT-PCR,衣霉素处理后蛋白质印迹结果,-actin,XBP-1s,XBP-1u,对照 24h 48h 72h 对照 24h 48h 72h,U266,RPMI-8266,二硫苏糖醇处理后蛋白质印迹结果,-actin,XBP-1s,XBP-1u,对照 24h 48h 72h 对照 24h 48h 72h,U266,RPMI-8266,小 结,小剂量的未折叠蛋白诱导剂对多发性骨髓瘤具有促分化作用细胞形态上更接近成熟浆细胞分泌的轻链蛋白的量增加表面标记CD49e表达增加GRP78,GRP94 发生了未折叠蛋白反应在转录和翻译水平XBP-1u,XBP-1s 证实，除了急性早幼粒细胞白血病（APL）以外，多发性骨髓瘤也可以采用诱导分化的治疗策略,2-甲氧基雌二醇通过干扰诱导性聚集体的形成而增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的凋亡效应。聚集体是一种特殊细胞器，可以将未折叠蛋白运输到溶酶体通过自噬途径降解。聚集体形成与微管聚集和解聚有关，受到乙酰化和去乙酰化调控、修饰。,2-甲氧基雌二醇,破坏硼替佐米诱导生成的聚集体从而促进骨髓瘤细胞凋亡。,聚集体阳性细胞(%),PPAR配体,15-脱氧前列腺素J2 曲格列酮,多发性骨髓瘤治疗的新靶点,应用配体激活 PPAR进而阻断STAT3信号靶向治疗,Wang LH,et al.Immunity,2004;29(2):113116.,探索新靶点,在国际上首次报道应用配体激活PPAR阻断STAT3信号转导通路，诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。,Weber SM,et al.Am J Physiol Endocrinol Metab.2004;287(6):E1171-7,PPAR配体诱导内质网应激胰岛细胞以减弱细胞因子信号,三氧化二砷,三氧化二砷抑制组蛋白去乙酰化酶活性，促使微管蛋白及HSP90乙酰化,以此干扰聚集体的形成及IB激酶的折叠,HDAC调节的蛋白,组蛋白去乙酰化酶调节的蛋白,Histone,HDACs,HDACs,-tubulin,HSP90,HIF-1a,HDACs,HDACs,HDACs,p53,组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）治疗多发性骨髓瘤主要是通过调节两个蛋白来发挥作用,分别是热休克蛋白90和-微管蛋白。,HDAC6,结果,0.1mol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性为对照组的83.5%，与对照组无明显差异（P0.05）0.5，1，2，4mol/L的As2O3处理组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的76.8%，72.3%，69.1%和62.8%（P0.05）2mol/L的As2O3分别处理细胞0h,24h,48h，24h组和48h组HDAC酶的活性较对照组下降,分别为对照组的74.7%和66.3%（P0.05）,As2O3对-微管蛋白乙酰化的影响,NCI-H929细胞随着处理浓度增加和处理时间的延长，-微管蛋白的乙酰化水平增加,上海长征医院,As2O3对HSP90乙酰化水平的影响,2.5mol/L和5mol/L As2O3处理MM细胞株 NCI-H929 48h后，与对照组相比，HSP90的乙酰化水平增加,As2O3对HSP90分子伴侣功能的影响,IP检测内源性HSP90与其客户蛋白IKK结合水平加入2.5mol/L As2O3处理48h后，与IKK的结合能力减弱，与HSP90结合的IKK减少,三氧化二砷与多发性骨髓瘤,对未折叠蛋白反应和多发性骨髓瘤的展望,UPR及其调控机制有待更深入彻底的把握研发更多靶点、更有效的化合物和制剂采用更釜底抽薪的治疗策略,致谢,易庆王利华屈晓燕邹建峰傅卫军,杜鹃姜华马仰丽熊红,周霞李荣张文皓袁振刚,NSFC（港澳合作重点项目,批准号0731160619）（批准号30670884）、（批准号30770924）、（海外合作重点项目,批准号30828017）、（批准号30270578）上海市优秀学科带头人基金、上海市领军人才计划,
