《实验中医学》2 实验中医学的基本方法 第二节 中医实验研究的基本方法与要求(111P)课件.ppt

1,第二节 中医实验研究的基本方法和要求,为什么要介绍“中医实验研究的基本方法和要求”？两条：（1）当代的医学实验业已形成一套比较完整、公认的方法学体系，长期以来推动了医学研究与探索的发展，丰富了生命科学，以及防病、治病的知识。这样的知识体系在国内外研究中被普遍采纳，中医药实验研究也不例外。因此要掌握。（2）中医实验研究，在选题、设计等方面还具有鲜明的学术特色，应予重视。,2,一、选题什么叫选题？选题是确定研究具体方向的过程。选题是开展任何一项科研活动的第一步，它是科研工作的起点，其目的就是要确定研究工作的内容和对象。“课题的形成和选择，无论作为外部的经济技术的要求，还是作为科学本身的要求，都是研究工作中最复杂的一个阶段，一般说来，提出问题比解决问题更困难。所以，评价和选定课题，便成为研究战略的起点。”（贝尔纳）选题是研究工作者对某一问题在理论认识上和实验手段方面的概括。,3,如何选题，如何选择实验研究的领域、范围？（一）选题的范围 总的原则和范围：“中医药学实验研究必须为防病治病，保护人民健康服务”。这句话涉及：医学、中医药学两个层次，表明是应用或应用基础研究。这是本专业的特色。比如2003年春夏之交在我国发生了“非典”，成为了万众瞩目的焦点，此时如何具体选题？能不能作为选题？什么叫“非典”？,4,非典的临床表现：病人通常以发热（体温38以上）为首发症状，多为高热，并可持续12周以上，可伴有寒战或其他症状，包括头痛、全身酸痛和不适、乏力，部分病人在早期也会有轻度的呼吸道症状（如咳嗽、咽痛等）。发病27天后，病人会有干咳、少痰、呼吸困难，少数进展为急性呼吸窘迫综合症，约10的病人需要机械性通气。血液化验时白细胞数大多正常或降低，胸部X线片显示出不同程度的肺炎改变。临床诊断：上述疑似病例（1）加胸片显示肺炎改变；上述疑似病例（2）加抗生素治疗无明显效果。,5,WHO关于SARS监测的病例定义：2003年4月1日，WHO公布SARS监测病例定义如下：（1）疑似病例定义 任何人2002年11月1日以来，表现有以下病史：发热（38）和 咳嗽或呼吸困难和 症状出现10天前有以下一项或多项流行病学暴露史 与疑似或可能SARS病例有密切接触 到过有SARS地方性传播地区（根据实际情况调整）的旅行史 有SARS地方性传播地区的居民（2）临床诊断病例定义 疑似SARS病例并且有胸部X线肺炎表现或呼吸窘迫综合症的X线表现或 疑似SARS病例尸检结果显示呼吸窘迫综合症的病理改变并且没有明确病因。,6,能不能作为选题？如何选题？一些给出的选题范围，可供参考：兵马未动，粮草先行。科研需要经费，经费哪里来？在我国主要有纵向课题经费与横向课题经费之分。纵向课题主要指国家到地方立项资助的课题。包括国家任务课题、指导性课题、自选课题等。横向课题指非纵向课题，一般由企业、事业单位，以及民间机构、个人等委托研究的课题。,7,国家任务 是国家根据国民经济发展规划与需求制订的科研项目，属于指令性的计划调节项目。如国家重点基础研究发展计划“973”计划项目、“十一五”国家支撑计划重大项目等。指导性课题 是国家自然科学基金委员会、国家中医药管理局、科技部、教育部、各省市科技厅/科技委员会、省市教育厅/教育委员会等部门设立的科研招标项目。如自然科学基金资助类别有面上项目、重点项目、重大项目、重大研究计划、国家杰出青年科学基金、海外及港澳青年学者合作研究基金、创新研究群体科学基金、国家基础科学人才培养基金、专项项目、联合资助基金项目以及国际（地区）合作与交流项目等。教材有详细的介绍。,8,自选课题 是指纵向课题未招标的课题，由科研人员根据科学发展需要和专长提出的课题。通常纵向课题会留有一定的资助空间，接受自选课题，并予以资助。委托研究 一般来讲是指接受企事业单位委托的应用基础及应用开发研究，如新药的药学研究、药理毒理学研究等。以上，除自选课题外，均有明确的招标指南，明确了选题的范围。大多研究人员会从中寻找有兴趣的领域，申报项目，开展研究。许多人以后会持续活跃在这一领域。,9,一些研究的分类：基础研究（应用基础研究）是运用现代科技方法和手段，对中医药基本理论、人与自然界、遗传与疾病的关系，以及病因与发病规律等给予探索，阐明中医药的特点和规律，如国家自然科学基金资助的项目多属此类。应用研究是指应用基础研究的理论知识和成果，使自然科学基础知识形成通用的技术原理和方法的研究，如参术胶囊治疗脾虚胃癌癌前病变的研究。开发研究是指把基础研究和应用研究的成果进一步开发应用于防病治病的新方法、新产品、新材料、新技术的研究，如前列消炎止痛片的药理毒理研究、银黄滴丸的新药开发研究等。,10,如何选题，有哪些基本原则？（二）选题的原则1需求原则。即选题的必要性，这是选题的最基本原则。必须根据国家经济建设和社会、学科发展的需要出发；以及根据中医药事业的发展以及中医教育、临床、科研的需要去选题。为什么？使得研究有意义、有价值，也容易获得经费资助。如何了解国家、地方和企业的需求呢？如何了解中医学继承和发展的需求呢？了解有关领域国内外研究动态、了解招标指南；长期投身中医药科学研究积累经验，发现需求、判断需求的轻重缓急。切忌凭个人好恶。,11,2重点原则。在若干选题中重要的，个人或项目组有能力完成的。对重点的判断，有赖于丰富的学识和科学的洞察力。如何选择？（1）研究各招标指南。这是捷径。（2）从自身的优势出发，扬长避短、发挥优势。例如，肝癌发病机制的研究、治疗方案优化的研究、肝癌腹水的研究、肝癌镇痛的研究、肝癌食疗的研究、肝癌脉诊的研究等，如何选择重点？选择哪些好些，哪些不宜选择？,12,3创新原则。不宜重复、炒冷饭。何谓创新？创新包含探索和创造两个连续的过程，探索是创新的前提，创新是探索中的发现和发明，是探索的结果和实现，是探索的新发展。探索是从“未知”向“已知”的迫近，而创新则是“已知”的到达，是把“尚无”的认识，变为“已知”的认识。创新涉及：理论、思路、方法、技术、成果等多方面。,13,如何做到选题的创新？（1）了解行情、动态，站在巨人的肩膀上。方法：查阅和研读大量的文献资料。早先“阴火”撰文冲动的故事。（2）研究中发现所存在问题、了解发展趋势、明确突破口/切入点，具备判断选题的洞察力。方法：开展长期的独立研究、探索、思索、博闻（包括学术沙龙）。研究人员、团队是关键因素；研究方法手段先进、高效是必要的。,14,4科学性原则。包含3方面：（1）依据充分。包括前人经验和个人积累。（2）符合客观规律。（3）符合科学和逻辑。例如对研究工作的手段、方法、进度、人才等做到合理组织、安排，人、财、物落实等。,15,5可行性原则。指主要技术指标实现的可能性，包括4个要素：（1）人力：个人和/或团队的知识结构、能力与素质、精力和年龄、专业及研究背景。（2）物力：研究条件，如实验室、仪器设备等。（3）财力：研究经费。（4）信息：获得信息及信息处理的条件。许多选题明显违反“可行性原则”，这是大多所申请项目未能批准的原因。6特色原则。中医药课题须突出中医特色，这也是客观存在的行业分工。,16,7效益性原则。指投资与预期成果的综合效益。投资者希望有所回报，主要是出成果、出效益。基础研究与应用研究不同：基础研究 期望达到新的科学水平和社会效益，集中体现在高水准的学术论文、专著、会议论文，产生广泛的学术影响；应用研究 则期望获得使用价值和经济效益。常见的问题是对此不了解、不重视，甚至混淆两者关系。总之，选题的原则包括：需求、重点、创新、科学、可行、特色、效益等7条。需要综合考虑和应用的。,17,中医药研究选题，有哪些基本思路？（三）选题思路选题思路指发现问题、提出问题、构思解决方案的思考过程。选题思路即是选题过程的思考阶段，思路往往来源于实践，比如从学习、教学、科研等活动中产生灵感。主要有这样一些经验：1从既往研究所开拓出的研究领域选题。这样的研究，可以是自己的，也可以是他人的（通过文献分析），这是选题的主要来源。在研究中，发现问题，提出问题，解决问题。,18,2从中医疗效优势出发。关键是如何确定优势所在，要有充分的依据。3从名老中医和民间有独特疗效的经验和疗法中去选题。这里也涉及到优势。4从中、西医理论的不同中去选题。前提是不同的理论确实反映了真实。5从西医空白点、中医特点出发去选取课题。类似于第4点。6从中医药文献收集、整理中去选题。同上，重点在开拓思路。,19,讨论 冬令进补临近冬至，市面上流行“进补”。说冬令进补，春季打虎。有人赞成，有人反对；有的处方昂贵，有的处方便宜；有的处方大，有的处方小，等等。忌口肿瘤患者手术、化疗等治疗后，体质虚弱，习惯要求进补。市面上盛传不能吃饲养场出品的鸡，要吃草鸡，或者不能吃鸡；甲鱼要野生的，不能吃人工养殖的。值得研究否？能不能作为选题？,20,（四）选题过程1大致明确范围、形成思路，初步以选题原则衡量，修正。这可以有一个过程，甚至会持续很长时间。2如果你已经开展了研究，那么仔细分析自己的研究结果，寻找新的选题是重要的途径。3查阅、研究、分析国内外有关文献。了解研究现状（甚至是沿革）、存在问题、发展趋势，寻找新的起点和突破口。目前最常用的是计算机关键词检索，比如前面介绍的CNKI，国际的PubMed等，一些流行的搜索引擎也可以。研究时间长了，会了解某一领域的知名学者，可以通过作者，检索其最新研究动态。初涉者，可以先检索某一领域的综述，了解大致进展，然后再跟踪综述后的进展。,21,4积极参加先进实验室的学术沙龙，小型研讨会，以及国内外一流的研讨会。了解和掌握最新信息与动态。5把初步的想法与同道和学术权威交流，听取意见和建议。这是捷径。有人担心，这样一来，思路可能被别人拿去。对此，你可以选择交流者。大多那些活跃在科研一线的学者，其研究往往已暴露出许多新的研究选题，往往无暇改变其研究方向，因此，不必多虑。而且，交流本身是双向的，可以相互借鉴的，这也是交流的目的。总之主动与具有经验者探讨、请教等，不失为有效的方法。6以上 5 条，往往交错进行，使得选题、假说、设计逐步完善。大多研究人员一直在从事这些活动。一些大型研究中心，甚至动态公布各研究小组、实验室最新研究进展，促进交流。,22,选题完成的重要标志之一是形成假说。什么叫假说？（五）假说假说是根据已知的医学原理和医学事实，对所研究中医学的现象及其本质规律所作的一种假定性的说明，是医学理论思维的一种重要形式。,23,1假说的构成要素和基本特点“艾滋病致病因子的逆转录病毒假说”便是一个医学假说的典型事例：艾滋病（AIDS），即人体获得性免疫缺损综合征，是当代最引人注目的一种新发现的传染病，被称为“超级肿瘤”。艾滋病的病因是什么？人们根据有限的事实材料，提出过种种假说，“逆转录病毒假说”就是其中一种重要的假说。1980 年和1982年期间，美国国立癌症研究院的Robert Gallo（加洛），从两个患同类型T 细胞癌的患者体内，成功地分离出一种能直接引起人类T淋巴细胞白血病的病毒（HTLV）。HTLV是一种逆转录病毒，它的遗传物质是RNA，感染细胞后其RNA转录为DNA，并整合到宿主DNA基因组内，导致细胞发生癌变。这提示HTLV就是人类T细胞白血病的特异抗原。,24,这期间（1981年），美国疾病控制中心首次报告了艾滋病病例，这种病不久便成了国际事件，引起了广泛的研究。这些研究表明，艾滋病是通过身体的密切接触或血液传播的，其特点与HTLV的习性一致；HTLV主要侵犯T细胞，艾滋病的缺损也正好在T细胞；HTLV在加勒比海地区和非洲呈地方性流行，这与艾滋病的流行专区也很一致。根据人体逆转录病毒的这种传染特征、流行特征与艾滋病特征的相似性，加洛提出了艾滋病致病因子的逆转录病毒假说。,25,那么，假说有什么特征呢？从上可见，假说由4个基本要素构成：（1）新的事实。如艾滋病的传染、免疫缺损和流行特征。（2）医学知识。如人类T淋巴细胞白血病病毒的传染特征、流行特征及病毒遗传学知识等。（3）对现象本质符合逻辑的推测。上述假说的形成大体上就是运用了这样一种规律，即HTLV有A、B、C、D特征，AIDS有A、B、C特征，HTLV是一种逆转录病毒，所以ADIS的致病因子也可能是一种逆转录病毒。（4）推演出来的预言或预见。,26,归纳起来，假说具有以下两个基本特点：（1）科学性。假说是建立在已有的医学理论和医学事实材料基础上的，它既不同于毫无事实根据的主观臆测，也不同于缺乏科学论证的科学幻想。（2）假定性。假说往往是在医学事实材料不充分的情况下，对疾病本质规律和因果关系的一种推测，带有假定性成分，有待于临床或实验的检验和理论论证，因而与确实可靠的医学理论不同。,27,为什么要提出假说？2假说的作用（1）在医学研究中的导向作用：提出新实验或新观察。（2）在医学认识中的桥梁作用：医学知识延伸的触角、藤蔓、桥梁，发现新知识、新领域。3提出假说应遵循的原则（1）解释性原则。指假说与事实的无矛盾性。（2）对应原则。指假说与医学理论的无矛盾性。（3）可检验性原则。指假说原则上要能够用实验进行检验。,28,假说的重要性事例：“在大学二年级第二学期的一次研讨会上，我第一次接触柏拉图的理想国（柏拉图）。它告诉我，一些重要问题需要提出来，这些问题并非全有答案；即便有答案，问题的提出也显得更为重要。”（哈佛书架，295，马丁.A.林斯基，哈佛大学约翰.肯尼迪管理学院讲师）,29,二、实验研究设计实验研究设计是指研究者制定实验的具体方法，包括明确受试对象，处理因素和方法，控制条件，观察指标等。周密的实验设计有助于获得资助，并取得高效获得可靠的研究结果。如何开展实验研究设计？实验研究设计包括哪些内容？有以下一些要求：（一）实验设计的3个基本原则哪3个基本原则？实验设计的3个基本原则对照、随机、重复。,30,为什么实验要遵循这3个基本原则？为了提高和保证实验观察结论的可靠性、真实性。1对照原则对照设立的目的：有助于判断处理因素的作用及其程度，发现处理因素以外其他因素的影响，有效地控制偏差。对照设立的要求：把研究对象随机地分入对照组与实验组，各组例数相等，保证对照组与实验组各条件一致，同时进行实验。对照的常见类型：正常对照、模型对照、空白对照、阳性处理因素对照、阴性处理因素对照、自身前后对照、交叉对照等。,31,2随机原则随机（Randomization）是指每个受试对象都有同等机会被抽取，尤其是保证不受研究者主观因素的影响。随机方法是指将实验对象随机分配到各组中，以保证各组之间的均衡性和齐同性。随机化方法一般采用抽签法和查随机数字表（或随机排列表）。前者简单易行，但不适用于观察例数较多的样本；后者利用随机数字表或随机排列表，选择可从任意行任意列开始，取出行列中的数字进行随机化分组，可以利用统计软件例如SPSS、SAS进行随机分组。,32,3重复原则重复（Replication，复制）是要求研究样本对于相应的总体具有代表性，因而要求研究样本满足与相应总体的同质性，以及足够的样本含量这两个条件。当研究样本同质性难以充分满足时，则要求扩大样本量；一旦当实验样本大小受到具体操作的限制时，则要求多次重复实验、多中心重复实验。,33,（二）研究设计的基本要素实验设计的基本要素包括处理因素、受试对象和实验效应。基本要素的正确确定直接影响到实验的结果。因此，任何一项实验都要从这3个要素着手，开展实验设计。研究设计有哪4个基本要求？即研究设计的3个基本要素：处理因素、研究对象、实验效应等基本要求，以及 样本大小的确定。1处理因素处理因素又称为研究因素，系指根据研究目的而施加的某种实验措施，例如：一种药品、一种治疗方法等。,34,（1）处理因素的性质及其分类1）自然因素，包括各种环境因素（物理的、化学的、生物的、社会的）和体内因素（如高血压、高血脂、年龄、性别等）。2）人为因素，是研究者从外部施加的干预因素，如治疗的药物，手术、心理危机干预等。通常实验的处理因素为人为干预因素，通过干预了解其效果。（2）非处理因素非处理因素指除处理因素之外的所有可能影响实验结果的因素。如年龄、性别、饮食、环境等均会影响实验的效果，但这些往往不是研究所提供，并关心的问题，属非处理因素。实验中要采取各种措施，尽可能使这些非处理因素控制在一定的程度内，且各组保持一致，以免影响到实验结果。,35,（3）处理因素的强度研究因素的次数、强度。例如，药物的每次剂量和总量。即使是研究对象本身所具有的某些特征作为研究因素，也有一个类似强度的问题。显然，研究因素的使用强度应适宜，过大则易伤害对象或实际上无法使用，过小则难以观察到应出现的效应，失去意义。（4）处理因素的数量一般来说，一次实验的处理因素越少越好。因为处理因素一多，对研究结果可能造成综合的、多方面的影响，不易分解各处理因素的作用，对结果分析带来一定困难。但在病因研究、影响诊断水平和疗效的因素分析中，又常用多处理因素，且每个因素可能还有多个水平，可用多因素分析的方法分出主要的和次要的因素，了解相互间的交互作用。,36,（5）处理因素的标准化处理因素在整个实验中应保持一致和稳定，否则将影响实验结果的准确性。如用药必须使用同一批号，药物在相同条件下保存，手术者操作熟练程度一致等。在正式研究开始后，不允许轻易更动，这样就能在整个研究过程中，使研究因素的条件始终一致，所获得的资料具有可比性，有利于分析研究因素与效应之间的关联。此外，在设计中应将研究因素的使用方法规定得具体、细致。标准的制定要求参考国家、专业学术团体颁布的有关诊断、治疗、药剂等标准。,37,撕纸实验（课堂作业）方法：左上角撕出方块形、中间撕出圆形、右下角撕出三角形。,38,撕纸实验方法：左上角撕出方块形、中间撕出圆形、右下角撕出三角形。具体方法：左上角方块正方形，边长50mm，左、上边距纸张边缘分别为20mm。中间圆圆点位于纸张正中，直径40mm。右下角三角直角三角形，直角边的右侧和下侧边与纸张右下角分别平行，距纸张边缘分别为20mm，直角边的边长为40mm。,39,该实验引申出的结论：（1）同样的提法，认识会有不同，学术争鸣部分来源于此（以往经验差异导致认知差异）；（2）方法要详细准确（常常出现：没有说清楚、定义不细致或不准确）；（3）工具要先进（尺、笔、剪）；（4）技术要培训、熟练严格的实验，可以达到精准的重复。“在科学研究中，说明概念的产生及测量的操作定义是必须的，这样才会使实验更为大众所周知，同时也使专业研究更加准确。”,40,方法问题的笑话：警察问醉汉在路灯下干吗，醉汉答道在寻找丢失在某个黑暗地方的钥匙，警察问他为什么不在丢失的地方找，醉汉回答，路灯下光线好科学在某种程度上就如同那醉汉，在它工具能够提供最好解释的地方寻找整理。以上事例的提示：（1）选择合适的方法，如白天。（2）发明创造新的方法，如金属探测仪。（3）拓展思路，积极进取；而非慵懒、迷恋或受制于已有技术、方法。中医药科研方法的选择也是如此。,41,2研究对象研究对象主要指正常人或患者、实验动物、组织器官或细胞。,42,3实验效应实验效应主要指处理因素作用于受试对象所引起的反映，这种效应将通过观察指标显示出来。观察指标按其性质的不同可分为：连续变量与离散变量。连续变量 又称计量指标、线性变量、量变量或区间变量，用整数、分数或小数来表示；变量的大小，在同类同单位之间存在着相等的距离，如身长、体重、血压、血钠等的计量。离散变量 又称计数指标，是将变量指标按其属性或类别分组，然后数清其个数，它又可分为有序等级变量和无序等级变量。,43,选择观察指标应注意如下问题：（1）特异性：指所选用的指标与研究目的要有本质上的联系，并能确切地反映出研究因素的效应，易于揭示研究问题的本质，不易为其他因素干扰，回答所要回答的问题。如观察药物的镇咳作用，就应该选择咳嗽的潜伏期和咳嗽次数作为评价指标。（2）灵敏度：指所选用的指标能够如实地反映研究对象体内微量效应变化。如研究某药治疗缺铁性贫血的效果，可以选用血红蛋白、血清铁蛋白的含量作为指标，但以血清铁蛋白的含量较能灵敏地反映处理因素的效应。（3）真实性（又称准确性）：系指研究结果与相应测定事物真实情况符合或接近的程度。由指标的灵敏性和特异性两个指标构成。,44,（4）客观性：指所选指标能客观地记录，不易受主观因素指标的影响。如在抗炎实验中，评价二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响时，选择耳肿胀度作为评价指标。当然还有一些细胞水平、分子水平的客观指标。（5）精确性：比如在长期毒性实验中，评价药物的安全性时选择血常规、肝功能（ALT、AST等）、肾功能（BUN、CREA等）等公认的精确指标。（6）可靠性（又称重复性、重现性）：指反复测量一种相对稳定现象时，所获结果彼此接近或符合的程度。,45,有人提出理想指标分为3类12个要求。第一类：合理性、正确性、特异性、重现性和客观性，这5个要求中不符合其中之一者，该指标就不能选用。第二类：灵敏性、无偏性、技术上可能性，这3个是对指标的进一步要求，选定时尽可能满足。第三类：可转换性或变换性（即从指标所测得变量直接看不出规律，要进行数学上的变换）、能分级（指质的指标，其变化程度可分级比较以便统计分析）、能与其他指标配合，以及对人体试验所用的指标的无害性。当选取两个以上的指标时，除应用每个指标说明效果之外，还需要把几种指标的结果综合在一起来总体评价。,46,（三）样本大小的确定（第三章论述详细，可参）样本量与处理因素、受试对象、实验效应，以及随机、重复等有关。若样本量过少，往往容易得到假阴性的结果，检验效能低，影响结论正确性；若样本量过大，会增加研究的困难，造成不必要的人力、物力、时间和经济上的浪费。样本大小的确定，就是要保证科研结论具有一定可靠性条件下，确定最小观察例数。1样本大小的粗略估计药理学有关大动物、中等动物、小动物数量参见教材。这主要是考虑到实验操作的可行性，数量大则难以操作，会增加实验的误差，且也成本高。,47,2决定样本大小的一些因素（1）各组别样本数量与实验设计有关。有些设计的样本需求量大，有些则小些。其大小依次为：完全随机设计配对设计随机区组设计拉丁方设计序惯设计，所需样本容量依次减少。（2）样本之间的个体差异越小，所需样本容量越少。（3）实验方法越精确，误差小，所需样本容量越少。（4）处理效果越明显，组间差别越大，所需重复数越小。（5）计量资料比分类计数资料所需样本数少，容易取得统计学意义。（6）实验样本数与检验水准成反比，比如取P0.01所需样本自然比取P0.05所需要的样本容量大。,48,3样本大小估算的一些指标一些指标：（1）具有研究指标的总体均数、总体率的估计值，样本均数、标准差S 及样本率P，这些值来源于以往的实验，通过查阅文献资料得到，或从预实验结果中得到。（2）确定容许误差，即相比较的两总体参数的差值，如=1-2。（3）第I类错误的概率（即检验水准）。越小，需要的例数越多。一般取0.05，亦可根据具体情况选取。（4）第II类错误的概率，1-又称为检验效能，1-越大，需要的例数越多。一般取=0.1，大则 易出现非真实的阴性结果，即假阴性结果。（5）考虑是单侧检验还是双侧检验。,49,4样本大小的估算（1）定性反应结果的样本容量估计（更正部分数据）（2）定量反应结果的样本含量估计1）两样本均数的比较2）治疗前后或配对计量资料的比较教材上有详细的论述，请仔细阅读。,50,（四）常用实验设计方案常用实验设计方案有哪些，各自的意义如何？如何选择应用？实验设计方案总的来说可以分为单因素与多因素两大类：单因素设计方案 就是一个观察因素的不同强度水平作用效应间差异的研究，或称为单因素K水平的实验设计（其中K=1为单组设计，K=2为配对或成组设计，K3为称为单因素多水平设计）。多因素设计方案 就是两个以上观察因素的不同强度水平作用效应间差异的研究，包括交叉设计、配伍组设计、拉丁方设计、裂区设计、正交设计、析因设计和具有重复测量的多因素设计。,51,教材介绍了9个实验，并附有实例，请参阅。1完全随机设计2配对设计3配伍组设计（先将条件相近的受试对象配成一配伍组，每个配伍组的受试对象数取决于对比组的组数，然后将每个配伍组中的受试对象按随机方法分配到多个对比组中去，给以不同处理。）4分层随机设计（首先根据研究目的，结合研究对象的特征，选定某些可能对研究结果有重要影响的的因素（非处理因素）进行分层，然后再从每一层中随机抽取研究对象按规定分配到各实验组去。）5交叉实验设计（将A、B两种处理因素先后施加于同一批受试对象，随机地使半数对象先接受A，后接受B；另一半对象先接受B，后接受A，两种处理在全过程中交替进行。）,52,6析因实验设计（是一种多因素（例如A两个水平、B两个水平）的交叉实验设计，可检验各因素之间的交互作用，节约样本含量。）7拉丁方实验设计（3个因素的实验，且三因素水平数相等；行间、列间、处理间均无交互作用。按拉丁方的字母，行和列安排处理及影响因素。）8正交实验设计（利用一套规格化的正交表，使每次实验的因素及水平得到合理的安排。用来找出各因素对指标的影响，并可指出哪些是主要的，哪些是次要的，哪个起独立作用，哪个起交互作用；选出各因素中的一个最佳水平。）9序贯实验设计（逐一实验逐一分析，一旦可以下结论时，立即停止实验。）,53,思考：中药讲究药性；中药配伍后，药性是否会发生变化？或者复方是否存在药性？西药是否存在药性？如何检测和评价中药、方剂，或者西药的药性？能不能设计这样的实验？是什么样的设计？,54,三、研究准备研究准备是实验研究过程中的关键环节。主要包括以下内容：1开题和项目论证。目的：（1）由专家审定项目设计是否可行，并提出建设性意见。（2）申请项目资助。2落实和管理研究经费。通过不同途径获得实验研究经费后，要求严格管理，专项专用。,55,3研究方法的突击进修大多初次从事实验研究者，以及那些具有长期研究背景者，将采用所不熟悉的新方法、新技术时，均要求对将要采用的技术、方法进行了解、比较，突击进修。比如类似技术的不同方法、研究条件、研究费用，方法的稳定性、重复性；以及具体操作、关键技术，检测单样本的耗时、前后支撑技术等。这些问题不解决、不掌握，会影响到实验的具体设计、安排，以及实验的质量。而了解这些的最佳途径就是进修，从头到尾亲身经历一遍，甚至几遍，到熟练掌握为止。4预初实验预初实验通常指在正式实验前的准备性、探索性的小实验，是为正式实验作铺垫、准备。,56,预初实验的内容广泛，比如开展导向性实验，以判断正式实验的意义；观察性实验，为正式实验参考；筛选性实验，对药物、技术、方法等进行筛选，如选定剂型（水煎剂、片剂等）、决定给药途径、确定剂量、对任何一种特定的分析方法的回收率、变异率、标准误差等进行试验性研究、估计正式试验动物数量和统计方法；决断性实验，初步验证假说，等等。广泛意义上的预初实验还包括熟练掌握仪器的操作方法、了解仪器的设计原理、校正仪器、造模和方法学建立等等，而这些对于一个初涉实验研究的学生、学者尤为重要。,57,预初实验的广度和深度也是不一样的。有时，以往的研究积累，在某种意义上讲也是在此基础上的后一项研究的预初实验。在本科生的教学中，预初实验往往包含技能的培训和实验方法建立的双重目的。对于那些缺乏研究基础，缺乏研究背景的初从事实验研究者，预初实验十分必要。没有这样的准备，直接耗巨资去从事某项实验研究是有重大风险的：实验者是否具备实验的能力，假说能否得到合理的验证，研究的思路和技术方案是否合理，等等均不明朗。这样不能树立起投资者的信心，获得资助的可能性会非常小。,58,5实验方法、实验材料、试剂的整理。正式开展实验前，要求整理出详细的实验方法；整理出详细的试剂、材料；整理出详细的仪器设备，以及操作方法。6研究对象、试剂、材料的准备（1）研究对象的准备：中医实验的对象主要有人、实验动物和细胞。要求细化和落实具体实验对象及其方法，包括与实验对象密切相关的实验环境、场所。如细胞生物学实验，选用哪一种细胞系，初步培养和传代，了解其生物特性。细胞培养环境及设备，如倒置显微镜、培养箱、超净台、无菌室等条件、环境要求准备就绪。,59,（2）试剂的准备：当试剂清单列出后，货比三家，制定出最为合理的购买计划，申购。获得试剂后，要求按试剂的存放要求，以及实验室试剂管理制度合理存放。一些具有危害性的试剂要求按有关规定进行使用记录，专人保管。所有试剂及其试剂母液应尽可能在实验前给予配置完成，贴上标签，按要求归类存放。对pH有要求的试剂，要求先调整试剂的pH值，最后才定容，以免失去调整pH值的容积。（3）材料的准备：申购实验材料，分类存储。以及玻璃试管、培养皿、量筒、漏斗的清洗等。,60,（4）中药制剂的准备：在中医实验中中药使用得十分频繁，经常在动物模型制作、治疗干预等方面使用。中药制剂的制备建议参考中药制剂专著，参考临床用药要求，必要时建议参考古代用药方法。制剂完成后应该按要求合理存放。标签上注明内容、浓度、日期等项目。7实验场所的准备和实验流程的制定（1）实验场所的准备，包括取材或组织材料收集的场所，以及实验观察的场所的准备。（2）制定详细合理的实验流程和方案。,61,四、实验实施实验实施是指在研究准备工作完成之后所开展的正式实验。实验实施的注意事项如下：1受试对象。首先依据研究计划，落实和筛选受试对象。受试对象要求符合实验要求，因此要依据条件逐一入选或剔除。然后依据研究计划进行分组，安排到不同的组别中去。比如购入一批小鼠后，进行初步检测，剔除那些体重过大、过小，或畸形者。一些要求造模的实验动物，在造模结束后，要求剔除那些造模不成功，以及那些不符合实验要求的模型动物，保证受试对象的条件近似。,62,2处理因素。严格按计划选用处理因素对受试对象进行干预，例如不同标准的治疗方法、强度、频率等，实验动物往往采用灌胃、注射等给药方法。以造模为目的的实验，实施造模方法，有采用中西药物的，有手术切除某一组织器官的，有模拟人类外伤的，有遗传筛选的，等等，应该根据不同实验的要求查阅有关文献确立，并观察模型成功与否。,63,3实验效应。大多实验，研究的主要工作在实验效应的观察、实验数据的收集与记录，以及实验数据的分析。（1）观察：观察大体可以分为非创伤性检测和创伤性检测两类。前者如测量血压、大多影像学检测，以及中医四诊的观察等；后者，创伤性检测，集中在动物实验，如某组织的取材、处理、组织中目标成分的检测等，涉及到大量的检测技术：生理、解剖取材、生化、病理、免疫、分子生物学技术等，一些新近发明或改良的方法技术，可以参考有关期刊的文献报道。当检测项目多、样本大、参与人员多，则要求制定详细的分工和安排。,64,观察往往是整个实验阶段占时间最长、涉及的人员最多、步骤最复杂的工作，因而也是最容易发生误差或差错的一环。因此，实验的质量控制应贯穿在实验的全过程，涉及到实验人员的质量意识、责任心、业务水平，仪器设备的检验和校正，实验材料及实验动物的标准化，试样的采集、预处理，测量和实验方法的规范与标准，仪器与试剂的校准与标定、全部操作到读取实验数据，以及实验环境控制等整个测量过程或测量系统的质量控制方面。,65,有两个概念：GLP（Good Laboratory Practice）：药品非临床安全性研究质量管理规范，即实验室优化管理规则。SOP（Standard Operation Procedure，标准作业程序）是将某一事件的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来，用来指导和规范日常的工作。SOP格式：标题、目的、职责、参考文件、材料器具、操作程序。这些对于实验的各个环节、步骤均有效。,66,（2）实验数据的收集与记录：任何一项实验结果均需用实验数据来说明。因此要求采用正确的收集方法，保证所获得的实验数据真实、可靠、全面。实验数据的收集的关键环节是实验记录。如实验检测结果的记录、临床观察记录、各种化验和检查记录、调查询问记录等。记录的表达形式根据指标的类型不同也不相同。无论采用何种获取或表达方式，都必须采取相应的措施确保实验结果的准确性。作好原始记录是执行科研设计的重要工作。原始记录是科研工作客观事实的唯一反映形式，是科研工作的最重要的档案。为了规范中医药科研实验记录，提高中医药科研实验质量，国家中医药管理局颁发了中医药科研实验记录规定，要求在实验研究中认真执行。其原则是恰当、统一、真实和准确、完整、清楚。,67,为了保证工作质量，应采用定人、定量、定质、定物的措施。定人即对一些重要的数据资料，由专门指定的或受过训练的人员去负责收集，不随便指派他人或经常换人；定量指按照设计要求每天必须完成的记录项目、次数等，使之形成习惯，避免遗漏；定质是为了保证数据质量的科学性，遵照规定的时间、操作要求、判断标准作出真实准确的记录；定物指自始至终使用同一个经过校准的检测用具，以减少仪器误差。同时在实验实施过程中要经常地、定期地进行检查，随时发现问题，及时给予解决和纠正，以保证顺利地、有质量地完成实验数据资料的收集工作。,68,4制定与贯彻研究计划（1）制订严密、细致的实施方案。涉及：按照科研设计方案把复杂的科研内容按不同的性质及要求分解为一个一个的研究问题，并对每个问题提出明确的技术要求。安排好各个研究问题的先后顺序及时间进度安排，把每天作的具体工作落实到具体的人员，认真详细地作好日计划、周计划、月计划等，需要对课题组成员进行明确的分工，制定出工作起止日期、工作量、技术要求等。并对研究过程中可能出现的某些问题进行必要的分析和提出预防措施。合理安排科研实验条件及经费。制订相关制度。如严格做好实验记录、质量控制制度、按时归档制度、定期检查制度、综合分析评价制度、奖惩制度等。,69,（2）实施条件落实和监督保障。涉及：课题组成员明确分工、定期交流实验进展情况，协调开展。涉及协作单位者，亦要求分工、研究时间节点明确和落实。项目承担单位要定期检查项目组项目开展情况，进行质量监控；并在人力、物力、财力和时间等方面给予保证和支持。,70,五、常见的偏倚、误差及控制方法1偏倚与误差 什么叫偏倚和误差？偏倚（Bias）是指在实验过程中，由于某些非处理因素的干扰所形成的系统误差，歪曲了处理因素的真实效果。偏倚实际上是一种系统误差，就是对真实情况的偏离。误差 是指实验中的原始数据与真实值之差，样本的统计量与相应的总体参数之差。,71,常见的有：（1）选择性偏倚：主要是纳入观察对象的方法不正确而产生的的偏倚。例如选入实验组和对照组的体重、年龄、性别等差异悬殊，影响到最后的实验结果。（2）测量性偏倚：测量性偏倚又称观察性偏倚，产生于科研实施阶段，系由于两个研究组所采用的测量和观察方法不一致所造成的系统误差。测量性偏倚常见原因如污染、干扰、依从和非依从、失访、检查和诊断结果不一致、观察记录的失误等。一些误差如：1）过失误差：指研究者在实验过程中偶然失误造成的误差。如阅读误差、抄写错误等，在实验过程中应注意检查，否则将影响实验研究结果的准确性。,72,2）系统误差：在实验过程中产生的一些误差，假若其值衡定不变，或按一定的规律变化，称为系统误差。3）随机误差：在同一条件下对同一对象反复进行测量，在极力消除或改正明显的系统误差之后，每次测量结果仍然会出现一些无规律的随机性变化，对这些变化称为随机误差。如果随机误差是服从正态分布，可用统计学的方法进行分析判断。（3）混杂性偏倚：观察结果时，由于与研究因素同时并存的非实验因素的作用，该作用影响到观察的结果，造成混杂因素的偏倚，称为混杂性偏倚。,73,如何在实验中控制偏倚和误差？2偏倚、误差的控制方法（1）选择性偏倚的控制方法1）强调严格的科研设计：多数偏倚发生于科研的设计阶段，可来源于选择研究对象或对照的不妥，如抽样方法不正确，诊断标准不统一，样本大小不适当，观察组和对照组缺乏可比性等。也可来源于决定调查方法和资料收集方法时考虑不周，如调查表设计不好，实验室指标缺乏质控，判断结果时缺乏客观的方法等。2）随机化方法和盲法，正确设立对照。3）采用分层/限制抽样的方法。4）配对。,74,（2）测量性偏倚的控制方法1）盲法实验。2）检查实验对象的依从情况。3）仪器设备的定期校正，操作技术的标准及执行，以及操作人员的培训。4）对每种实验方法、诊断