《DNA和蛋白质技术》ppt课件（新人教版选修1）.ppt

新课标人教版课件系列,高中生物选修,专题DNA和蛋白质 技术,教学目标,知识与能力、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，、了解DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；、理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。、二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。【课题重点与难点】课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。,课题DNA的粗提取与 鉴定,专题DNA和蛋白质技术,复习巩固:(1)如何观察DNA和RNA在真核细胞中的分布情况?(2)真核细胞DNA的主要存在场所?(3)证明DNA是遗传物质的三个经典实验?(4)DNA分子双螺旋结构模型的提出者是谁?(5)DNA分子双螺旋结构模型的主要特点?,1、DNA分子由两条链组成,这两条链按反向平行的方式盘旋成双螺旋结构.,2、DNA分子中的磷酸和脱氧核糖交替连接.排列在外侧,构成基本骨架,碱基排列在内侧.,3、DNA分子两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对.,1、你所知道的生物大分子有哪些?,2、如何来提取生物大分子?,3、提取DNA的基本思路是什么?,4、可以将DNA溶解于水和其他物质分离开来的方法吗?,学生活动1:,一、基础知识,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。,1、DNA能溶于酒精溶液吗？,2、细胞中的其它物质呢？,3、由此你想到了什么?,4、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性?,学生活动2:,二、实验方法及注意事项,（一）实验材料的选取,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,学生活动3:,1、怎样使鸡血细胞破裂？原理是什么？,2、如果实验材料是植物细胞又该如何处理？,3、加洗涤剂和食盐的作用是什么？,4、提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,探究活动4:,1、此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,2、为了纯化提取的DNA需要将滤液作怎样的进一步处理？,3、为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,4、方案二和方案三的原理有什么不同？,（四）DNA的析出与鉴定,学生活动4:,3、如何鉴定DNA分子？应注意什么？根据你前面所学的知识，还可以用什么物质来鉴定？,2、纯的DNA应该是什么颜色？,1、怎样使鸡血细胞破裂？原理是什么？,1.制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）,500mL烧杯中，玻棒搅拌，离心、分离或静置沉淀。,2.提取DNA。,取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向快速搅拌。,纱布过滤：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。,.提取血细胞核物质：,.溶解核内的DNA：,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌。,三、实验步骤,.析出含DNA的粘稠物：,.滤取含DNA的粘稠物：,.DNA粘稠物的再溶解：,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。,用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。,.过滤含有DNA的NaCl溶液：,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤所得的溶液，滤液中含有DNA。,.提取含有杂质较少的DNA：,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。,3.DNA的鉴定：,加入二苯胺试剂4mL，用玻棒搅拌使DNA溶解，沸水浴5min，观察溶液是否出现浅蓝色。,1.共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌”,2.加入“两次蒸馏水，三次NaCl溶液，一次酒精”,三、实验小结,四、实验原理拓展介绍。,1.DNA的释放。,DNA主要在鸡血细胞的细胞核内，正常情况下不会释放出来，蒸馏水对于鸡血细胞是一种低渗液，水分可以大量进入血细胞，使之胀破，同时加上玻璃棒快速搅拌的机械作用，加速血细胞的细胞膜和核膜的破裂。但释放出来的大量DNA与RNA、蛋白质结合在一起，即释放的不是纯净的DNA，常称为DNA核蛋白。,2.DNA与蛋白质分离。,在高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高浓度的氯化钠溶液中,3.DNA的析出与获取。,因为DNA在低浓度（0.14mol/L）的氯化钠溶液中溶解度小，而蛋白质的在其中的溶解度大。所以在向含DNA的高浓度的氯化钠溶液中加入大量蒸馏水稀释氯化钠溶液，从而使DNA溶解度下降，蛋白质溶解度增高。,4.DNA的再溶解。,用高浓度（2mol/L）的氯化钠溶液再溶解DNA粘稠物。,5.DNA的沉淀和浓缩。,对于除去了蛋白质的DNA的氯化钠溶液，必须再进一步沉淀和浓缩，常用酒精沉淀法。即往含有Na的DNA溶液，加入体积分数为95%的冷却酒精，混匀后可以使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物，悬浮于溶液中。若丝状物较少，可将混合液再放入冰箱中冷却几分钟即可。浓缩后的DNA丝状物可以用玻棒（玻棒有吸附DNA的作用）缓缓旋转的方法卷起。,6.DNA的鉴定。,鉴定时蓝色的深浅与溶液中DNA的含量多少有关。,加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固,加速血细胞破裂,溶解DNA,使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出,使含DNA的黏稠物被留在纱布上,使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中,除去含DNA的滤液中的杂质,提取DNA,A出现蓝色 B无变化,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是()。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,答：B,答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出,3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成()A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色,4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,答：D,课题多聚酶链式反应扩增 DNA片断,专题DNA和蛋白质技术,一、基础知识,（一）、PCR技术的概念 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝（二）、PCR技术的应用遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定,PCR的应用1,从蓝藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶),清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品,基因库检索 SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白,PCR的应用2,检测粉末样品是否含有炭疽杆菌,炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。,有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR,PCR的应用3,基因测序,一、基础知识,（三）、PCR技术的原理,1、体内DNA复制的条件：,解旋酶,DNA母链,4种脱氧核苷酸,DNA聚合酶,引物（RNA）,打开DNA双链,提供DNA复制的模板,合成子链的原料,催化DNA子链合成,使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸,变性（80-100）,Taq聚合酶（耐高温）,2030个核苷酸构成,是一小段DNA或RNA,ATP,提供能量,2、DNA合成的方向,（1）DNA单链两端的命名,基本单位脱氧核苷酸,脱氧核糖,磷酸,T,1号碳,5号碳,3号碳,连 接,5，端含磷酸基团,3，端（含羟基）,3，端,5，端,DNA单链两端的命名,（2）DNA聚合酶的特性,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。,2、DNA合成的方向,（3）DNA合成的方向,从子链由5 端向 3端延伸,3、DNA复制的前提是_用_方法,思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA 如何打开双链？,双链的解开,控制温度,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,4、DNA 分子的热变性原理：PCR仪原理,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物和引物与两条单链的结合,思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活,_找到耐高温DNA聚合酶,P21托马斯.布鲁克,5、体外DNA复制的条件(PCR 反应的条件),DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；控制温度，但不需解旋酶.,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率,二、PCR的反应过程,1、循环之前的一次预变性,2、PCR 一般要经历三十多次循环,（1）变性：当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,二、PCR的反应过程,3、每个循环包括：变性 复性延伸,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（1）PCR循环-变性,95变性,（2）PCR循环复性,55复性,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,（3）PCR循环延伸,4、循环特点：,上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代DNA分子中 其它子代DNA分子都为双引物分子式 处于两引物之间的DNA序列呈指数增长12N,练习：见课课练P79第10题,二、实验步骤：,准备好PCR反应体系的配方,用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁,离心10分钟,将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序,电泳检测PCR结果,三、操作提示：,操作提示 1为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。,目的：,避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。,四、结果分析与评价,1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。,四、结果分析与评价(了解),2、具体方法如下。1）将样品进行50倍稀释：取2LPCR反应液，加入98 L蒸馏水。2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。3）加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。4）根据下面的公式计算DNA含量。DNA含量(g/ml)=50 x(260nm的读数)x稀释倍数,五、课题延伸,1、PCR优点：2、PCR技术的意义,原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作,复习：PCR技术与体内DNA复制的区别：,1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；,2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；,3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。,练习,1、书本2、课课练,练习：见课课练P79第10题,9 下图为PCR过程的前三次循环的图解，请据图回答：()请将PCR缓冲液中提供的4种组分填写在图中的方框内：(2)第一轮循环中变性 是指_；复性 是指_；延伸是指_。(3)假设PGR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为 Nl，第二轮的产物4个子代DNA为N2，第二轮的产物8个子代DNA为 N3，则Nl、N2、N3中分别含有模板DNA单链的DNA分子，_、_个，若继续循环36次，则N 36中将有个DNA分子含有模板DNA单链。(4)N3的8个DNA分子中是以N2中的_为模板复制而来的，是以N2中的 为模板复制而采的，是以N2中的 为模 板复制而来的，是以N2中的 为模板复制而来的。从图中可以看出，DNA聚合酶只能特异地复制处于2个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增，原因是_,练习：见课课练P79第10题,练习二(课堂检测),1、DNA单链的_末端为3,端,_末端为5,端,在DNA复制时,引物从模板链的_端配对结合.在_酶的作用下,引物提供_端,使子链向下延伸.2每次循环可以分为_这三个过程,对应温度分别为_.,练习二(课堂检测),3、一个DNA片段经过30次循环后能形成_个这样的片段.4依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得DNA=_,练习二(课堂检测)答案,练习二(课堂检测),1、DNA单链的_末端为3,端,_末端为5,端,在DNA复制时,引物从模板链的_端配对结合.在_酶的作用下,引物提供_端,使子链向下延伸.2每次循环可以分为_这三个过程,对应温度分别为_.,磷酸基团,羟基,羟基,DNA聚合,3/,变性、复性、延伸,95、55、72,练习二(课堂检测),3、一个DNA片段经过30次循环后能形成_个这样的片段.4依据DNA吸收紫外光的情况,用紫外分光光度计测得DNA=_,230,50 x(260nm的读数)x稀释倍数,课题血红蛋白的提取和 分离,专题DNA和蛋白质技术,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,2.提问：血液有哪些成分？,1.提问：用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、血红蛋白的提取和分离,3.高温灭菌和酒精灭菌的结果：,使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大 小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,1.概念：,3.凝胶色谱法的原理分子筛效应：,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,2.作用:,3.缓冲溶液的配制:,通常由12 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性),磷酸缓冲液,缓冲溶液的组成及分类,弱酸及其对应的盐：,弱碱及其对应的盐：,多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐:,H2CO3NaHCO3；CH3COOHCH3COONa,NH3H2ONH4CL;NH4OHNH4CL,NaHCO3Na2CO3；NaH2PO4Na2HPO4,缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中，能对抗外来强碱的称为共轭酸；能对抗外来强酸的称为共轭碱。这一共轭酸碱通常称为缓冲对、缓冲剂或缓冲系。常见的缓冲对主要有如下三种类型：,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,聚丙稀酰胺凝胶电泳,1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。,2.原理：,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3.SDS作用机理:,用SDS测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。,洗涤操作：,1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。,采集得到鸡血,柜式离心机,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,二、实验操作,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,(4)透析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,二、实验操作,透析过程动画演示,利用透析袋透析,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装配好的凝胶柱,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（2）凝胶色谱柱的装填,50cm高,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,（3）样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺:用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）:用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10%过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸(pH 8.3)，0.1%的SDS。样品处理液：50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液：0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。,1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。,注意事项：,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：,3、电泳方法步骤,（3）样品处理：在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,3、电泳方法步骤,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,三、实验结果分析与评价,本课题作业;,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?3.电泳的作用及其原理是什么?4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?,再见,