中药制剂的鉴别课件.ppt

,第二章中药制剂的鉴别,第一节定 性 鉴 别,定性鉴别：,利用各单味药材的形态、组织学特征及其所含化学成分的结构特性、化学反应、光谱特性、色谱特性及某些物理化学常数来鉴别中药制剂中各单味药材的真伪及存在与否的分析方法。,方法：1.性状鉴别2.显微鉴别法3.理化鉴别法 1）一般化学反应法 2）升华法 3）荧光法 4）光谱法 5）色谱法,性状鉴别,一、基本内容,二、主要中药剂型形状要求,形状、大小、颜色、表面特征、气、味、其他,丸剂、片剂、散剂、颗粒剂、锭剂、煎膏剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、膏剂、贴膏剂、胶剂,中药制剂的显微鉴别 利用显微镜来观察中药制剂中原药材的组织碎片、细胞或内含物等特征，从而鉴别制剂的处方组成。凡以药材粉碎成细粉后直接制成制剂或添加有部分药材粉末的制剂，由于其在制作过程中原药材的显微特征仍保留到制剂中去，因此均可用显微定性鉴别法进行鉴别。,显微鉴别,制片方法：散剂、胶囊剂：取粉末少量，选用适当的试液处理后直接进行显微观察。片剂：切开，刮取少量样品，观察；粉末及粗则先研细；糖衣片除去糖衣再研细。水丸、颗粒剂：于乳钵内研成粉末后观察。蜜丸：可取1丸从正中切开后，刮取少量样品进行观察,注意：在本法鉴别中，只有药材原有组织结构特征能保留到制剂中，才有意义。全部由溶剂提取的制剂，不用此法进行鉴别。不同剂型其制片方法不同。应选择在该制剂中没有干扰又能表明该味药存在的显微特征作为鉴别依据。,应用实例-六味地黄丸的显微定性鉴别,显微鉴别：取本品置显微镜下观察，(1)薄壁组织棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物。(熟地黄)(2)果皮表皮细胞橙黄色，表面观类多角形，垂周壁略连珠状增厚。(山茱萸）(3)淀粉粒三角状卵形或矩圆形，直径2440um，脐点短缝状或人字状。(山药)3a草酸钙针晶束3b淀粉粒(4)草酸钙簇晶存在于无色薄壁细胞中(5)不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛溶化；菌丝无色，直径4-6um。(茯苓)(6)薄壁细胞类圆形，有椭圆形纹孔。,显微特征 Microscopical characters,生物显微镜-数码成像系统,F.unibracteata,F.cirrhosa,F.przewalskii,F.thunbergii,浙贝母,川贝母及其伪品浙贝母幼小鳞茎的性状和显微特征,两者性状和显微特征难以区别,人参（主根）横切面 Transverse section of ginseng Main root,Cork 木栓层,Cortex 皮层,Phloem 韧皮部,Cambium形成层,Xylem 木质部,1、水牛角浓缩粉,2、麝香,3、珍珠,4、朱砂,5、雄黄,6、黄连,7、栀子,8、郁金,9、黄芩,安宫牛黄丸,郁金糊化淀粉团块栀子种皮石细胞黄芩纤维黄连纤维朱砂不规则块状物或颗粒状物，暗红棕色、鲜红色或棕黄色,理化鉴别,显色、荧光,试剂,组分,一般化学反应法（General Chemical Reaction）,利用检测试剂与制剂中的指标性成分发生化学反应，根据所产生的颜色、沉淀或气体等现象，来判断某些成分或某些药味的有无。,中药制剂一般选择有效成分、特征成分作为鉴别的对象。一般化学反应鉴别法多在试管中用湿法反应进行，制剂样品要先制成适宜的供试液。一般情形下用50-70乙醇回流提取制备供试液。,二特点 1.一般化学反应法具有操作简便，适用性较强等特点。2.其否定功能往往强于肯定功能,专属性较差。3.易发生假阳性或假阴性反应,一般化学反应法应该注意以下几点：(1)慎重使用专属性不好的分析反应，如泡沫生成反应、三氯化铁显色反应等。(2)在分析前对样品进行分离、精制，除去干扰分析反应的物质，借此改善鉴别方法的专属性。(3)采用阴性对照和阳性对照的方式，对拟定的鉴别方法进行反复验证，防止出现假阳性。,三、常用的一般化学反应,主要用于制剂中生物碱、黄酮类、蒽醌类、皂苷、香豆素、萜类以及各种矿物类成分的鉴别（一）生物碱 1.碘化铋钾反应 产生红棕色沉淀 2.碘化汞钾反应 产生类白色沉淀 3.硅钨酸反应 产生白色沉淀 4.苦味酸反应 产生黄色结晶性沉淀 需在酸性条件下进行。注意事先排除其它成分的干扰。少数生物碱不与上述通用沉淀试剂反应，而具有专属性较强的其它反应。,（二）黄酮类化合物,最多使用的检识反应为盐酸镁粉反应，呈紫红色。大山楂丸（山楂）、抗骨增生丸（淫羊藿）、参茸保胎丸（黄芩）等。此外，黄芩提取物采用二氯氧锆-盐酸显色反应进行检识。（三）蒽醌类化合物 主要应用碱液反应（Borntrager反应），阳性反应呈红色，加酸红色褪去呈黄色。例如大黄流浸膏。,（四）皂苷,常用的定性鉴别反应有：泡沫反应 样品水溶液振摇后，产生持久性泡沫。醋酐浓硫酸反应 甾体皂苷呈现污绿色，三萜皂苷呈现红、红紫色。浓硫酸反应 呈现红、红紫色。三氯化锑或五氯化锑反应 氯仿液呈紫兰色。氯仿浓硫酸反应 氯仿层出现红色或兰色，并具绿色荧光。例：地奥心血康胶囊（黄山药和穿山龙薯蓣的提取物）、养心定悸膏（甘草、红参、麦冬）。,（五）香豆素、内酯类和酚类,常用的检识反应有：氯亚氨基-2，6-二氯醌-四硼酸钠反应（Gibbs反应），呈现蓝色。异羟肟酸铁反应 呈红色。应用品种有：养阴清肺膏（牡丹皮）、前列舒丸（牡丹皮）等。,（六）挥发性成分 主要使用香草醛浓硫酸反应检识此类成分，正反应呈红、红紫色。应用品种主要有：万应锭（冰片）、牛黄解毒片（冰片）、养心定悸膏（桂枝、生姜）等。,（七）矿物药,朱砂、石膏、雄黄等为中成药中常见的矿药。1.朱砂（主含HgS）主要采用铜片反应。HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg（白）+H2S 天王补心丹等中成药中朱砂的鉴定。2.石膏、牡蛎、海螵蛸等 此类药物均富含钙盐，主要采用草酸铵反应。CaSO4+(NH4)2C2O4CaC2O4（白）+(NH4)2SO4 CaC2O4溶于盐酸，难溶于醋酸。CaC2O4+2HClCaCl2+H2C2O4 止咳桔红口服液（石膏）、安胃片（海螵蛸）、龙牡壮骨颗粒（牡蛎、龙骨、乳酸钙、葡萄糖酸钙等）,3.雄黄（主含As2S2）（1）氯化钡沉淀法（检出硫）As2S2+KClO3+4HNO3 2K3AsO3+H2SO4+Cl2+4NO H2SO4+BaCl2 BaSO4（白）牙痛一粒丸（2）硫化氢反应（检出砷）2As2S2+7O2 2As2O3+4SO2 As2O3+3H2O 2H3AsO3 2H3AsO3+3H2S As2S3(黄)+6H2O As2S3在盐酸中析出黄色沉淀，并溶于碳酸铵中 4As2S3+12(NH4)2CO3 4(NH4)3AsO3+4(NH4)3AsS3+12CO2 小儿惊风散等。,o,（八）动物药,常含有较多的蛋白质或氨基酸，故鉴别此类药物，常使用茚三酮反应，正反应呈红紫色。例如：龟龄集（鹿茸、海马、等）、参茸保胎丸（阿胶、鹿茸）等。,四、操作方法,（1）供试液的制备（见前述）（2）操作方式 大多为试管反应，或在检测试纸上、或在蒸发皿（坩埚）中进行反应,五、结果判断 将反应现象或结果与药品标准对照，若一致则符合规定。若不一致则判定为不符合规定。,六、注意事项,试管反应一般使用210cm试管，取供试液12ml。加入检测试液时，试管应稍倾斜，试液应沿试管内壁逐滴加入，滴管下口不得触及内壁。加入反应试液后一般需振摇试管，使之与供试液混匀。振摇时应缓缓摇摆振摇，不得上下振摇，手指不允许堵塞试管口，若需层反应，则不得振摇试管。一般需在白色背景下观察反应所产生的颜色或沉淀，若沉淀为白色或类白色则需在黑色背景下观察。如果反应需加热，一般在水浴中加热。用试管夹夹持试管，内容物不得超过容积的2/3，试管应倾斜45度，试管口不得闭塞，并不得朝向人。加热有机溶液绝对不允许使用明火热源。如果反应需无水条件，必须保持试管、蒸发皿等容器的干燥，例如醋酐浓硫酸反应。,七、应用实例,1.千柏鼻炎片2.小儿清热止咳口服液3.茴香橘核丸4.地奥心血康胶囊5.养阴清肺膏,6.安胃片7.天王补心丹8.牙痛一粒丸9.中风回春片,取本品6片(去包衣)，研细，加乙醇10ml，温热10分钟，过滤，滤液作如下反应：(1)取滤液5ml，加镁粉少量与盐酸0.5ml，加热，即显红色。（黄芩中有大量黄酮）(2)另取滤液4ml，加氢氧化钠试液，显红色，再加30过氧化氢溶液，加热，红色不消失，加酸或酸性时，红色变为黄色。（大黄中含有羟基蒽醌）,实例：牛黄解毒片中大黄、黄芩的定性鉴别反应,附：显微化学鉴别法(一)取药材的切片、粉末或中成药粉末，置载玻片上，滴加各种试剂，加盖玻片，在显微镜下观察产生的结晶或沉淀，以及特殊的颜色等，作为鉴别的特征。例：穿心莲用水湿润，切成横切片，滴加乙醇后加Kedde试液，叶肉组织显紫红色(穿心莲内酯成分的不饱和内酯环反应)。,(二)取药材粗粉加适当的溶剂浸提，将浸提液置载玻片上，滴加各种试剂，加盖玻片，在显微镜下观察反应。例如：槟榔粉末0.5g，加水34ml及稀盐酸1滴，微热数分钟，过滤，取滤液1滴于载玻片上，加碘化铋钾试液1滴，即发生混浊，放置后可见石榴红球形或方形结晶(槟榔碱)。,(三)取药材切片或粉末，滴加各种试剂，直接观察反应现象。例如：钟乳石少许，加浓盐酸数滴，能产生大量气泡(碳酸盐分解产生CO2)。番木鳖胚乳薄片，加1钒酸铵-硫酸试液1滴，胚乳速显紫色(番木鳖碱)，另取切片加发烟硝酸1滴，即显橙红色(马钱子碱)。,升华鉴别法（Sublimation）,一、原理 本法是利用某些成分的升华性，在一定温度下将其从制剂中升华分离出来，并以升华物所具有的某些理化性质作为制剂鉴别的依据。,二、特点 升华法具有简便、实用等特点，由于升华性仅为少数中药化学成分所具有且升华物纯度较高，故该法专属性亦较好。,三、操作方法 大多采用微量升华法，少数使用坩埚法或蒸发皿法，在此，仅介绍微量升华。,六味地黄丸中冰片升华物,六味地黄丸中冰片升华物显微镜下观,六味地黄丸中冰片升华物香草醛浓硫酸显色,四、注意事项 升华时应缓缓加热，温度过高，易使药粉焦化，在载玻片上产生焦油状物，影响对升华物的观察或检识。温度的控制可通过调整酒精灯火焰与石棉板的间距来实现。样品粉末用量一般约0.5g，过少不易产生足够量的升华物。可在载玻片上滴加少量水降温，促使升华物凝集析出。无金属片，可用载玻片代替。,五、应用实例,(一)万应锭的鉴别（二）小儿惊风散的鉴别（三）明目地黄丸的鉴别,实例 牛黄解毒丸微量升华鉴别 取本品进行微量升华，先得白色升华物后（冰片），继得黄色升华物（大黄中蒽醌）。将升华物分别置显微镜下观察：白色升华物呈不定形的无色片状结晶，加新制的1香草醛硫酸溶液，渐显紫红色，黄色升华物呈黄色针状结晶或羽状结晶，遇碱显红色，遇酸变为黄色。,荧光鉴别法（Fluorescence）,一、原理 荧光鉴别法是利用制剂中某些成分，如黄酮类、蒽醌类、香豆素类等在可见光或紫外光照射下能产生一定颜色荧光的性质，对中药制剂进行鉴别。有的成分本身不具荧光性，但加酸、碱处理后，或经其它化学方法处理后也可产生荧光供鉴别用。,二特点 本法操作简便、灵敏，具有一定的专属性。例如大黄和土大黄，前者显棕色至棕红色荧光，而后者显亮蓝色荧光，很容易区分。,三、操作方法 取中成药的提取液点加于滤纸上或加入蒸发皿中，置紫外光灯（365nm）下约10cm处观察所产生的荧光。必要时可在供试品上加酸、碱或其它试剂，再观察荧光及其变化。,四、注意事项 荧光强度较弱，故一般需在暗室中观察荧光。供试液一般用毛细管吸取，少量多次点加在滤纸上，使斑点集中且具有一定浓度。紫外光对人的眼睛和皮肤有损伤，操作者应避免与紫外光较长时间接触。,五、应用实例（一）元胡止痛片（二）五味麝香丸（三）热炎宁颗粒,紫外-可见光谱鉴别法(Ultraviolet and Visible Spectroscopy),一、原理 某些中药或中成药经适当处理后，所得紫外吸收光谱是由其各组分的特征吸收叠加而成的。若将中药制剂作为一个特定的整体，在一定测试条件下，只要各药味及其成分的组成与含量相对稳定，则其紫外吸收光谱具有一定的特征性和重现性，可以用于定性鉴别。,两组分的加和紫外吸收光谱,二、定性鉴别,定性鉴别的依据吸收光谱的特征 吸收光谱的形状 吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度 相应的吸光系数,1对比吸收光谱的一致性,同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较,2对比吸收光谱的特征值,3对比吸光度或吸光系数的比值：,例：,三、特点分光光度鉴别法简便、灵敏、易普及。但由于紫外光谱分辨率较低，图谱简单，某些不同的样品可能给出极其相似的光谱图，使其在实际工作中受到一定的限制。如果对样品进行前处理，除去干扰成分，则可有效地提高该法的专属性。中国药典仅有少数中成药品种收载了分光光度鉴别法，例如，木香槟榔丸等。中国药典规定以最大吸收波长（max）做为鉴别参数。样品吸收峰波长应在该品种项下 规定的波长2nm以内。,复方丹参片紫外谱线组图,四、操作方法五、注意事项六、结果判断 将供试品最大吸收波长和药品标准的规定进行比较，二者如果一致，则判定为符合规定。,七、应用实例 木香槟榔丸 处方：木香、槟榔、枳壳、陈皮、青皮（醋炒）、香附（醋制）、三棱（醋制）、莪术（醋制）取本品粉末4g，置蒸馏瓶中，加水10ml，使供试品湿润后，水蒸汽蒸馏，收集馏液约100ml，照紫外分光光度法（中国药典附录V A）测定，在253nm波长处有最大吸收。（检出挥发性成分）,色谱鉴别,TLC法-应用最多（Rf、颜色、荧光）,GC法-适用于含挥发性成分的药物,HPLC法-常与含量测定同时进行,气相色谱鉴别法(Gas Chromatography GC)一、原理,在一定的色谱条件下，相同的物质应具有相同的色谱特性（分配系数）和色谱行为（保留值）。因此，在同一色谱条件下，将供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪，对二者的气相色谱图进行比对，根据供试品是否给出与对照品保留时间相同的色谱峰，从而对样品作出定性分析。这种方法可称为保留时间比较法，中国药典即采用此法对某些中成药进行真伪鉴别。保留时间（tR）系指从进样开始，到该组分色谱峰顶点的时间间隔。,色谱峰示意图,二、特点 气相色谱法具有高分辨率，高灵敏度、快速、准确等特点，尤其适合分析制剂中的挥发性成分，如麝香酮、薄荷醇、冰片、水杨酸甲酯等。一般情况下气相色谱不适合分析蒸汽压较低的也即挥发性较小的成分，因此该法在实际工作中具有一定的局限性。,三、操作方法 四、注意事项,气 相 色 谱 仪,五、结果判断 比较供试品与对照品色谱图，供试品呈现与对照品保留时间相同的色谱带，则判断为符合药品标准规定。所谓保留时间相同是指基本相同，彼此相差百分之几秒是允许的。,六、应用实例（一）少林风湿跌打膏（二）安宫牛黄丸中麝香的鉴别,-麝香酮,安宫牛黄丸,高效液相色谱鉴别法（High Performance Liquid Chromatography HPLC),一、原理 高效液相色谱法鉴别在原理和操作上与气相色谱鉴别法有许多相似之处。中国药典采用保留时间比较法，即在相同的色谱条件下，比较样品和对照品的色谱峰的保留时间（tR）是否一致，从而对被检成分（药味）的存在情况做出判断。例如，六味地黄丸中芍药苷和四君子丸中甘草酸的鉴别。,六味地黄丸中芍药苷的高效液相色谱图(a.芍药苷)A.芍药苷对 照品 B.六味地黄丸供试品标准品,二、特点 高效液相色谱法不受样品挥发性的限制，固定相、流动相的选择范围较宽，检测手段多样，加之高效快速，微量，自动化程度高等特点，所以在药物分析工作中比气相色谱法应用更为广泛，在中药制剂鉴别中的应用也日益增多。不过，目前在中药制剂质量标准中，一般很少单独使用该法做鉴别，而是多与含量测定结合进行。,三、操作方法 四、注意事项 五、应用实例（一）龙牡壮骨颗粒中维生素D2鉴别（二）百令胶囊的鉴别（05版新增内容）本品系由发酵虫草菌粉（CS-C-Q80）制成。采用高效液相色谱法鉴别其中的核苷类成分。,核苷类成分的鉴别：样品先用乙醚脱脂，再用0.5磷酸溶液超声波提取制成核苷供试液。用反相高效液相色谱法测定，以乙腈为流动相A，以0.04mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱，供试品色谱应呈现与对照药材色谱保留时间相同的六个主色谱峰，与腺苷、尿苷对照品保留时间相同的色谱峰。时间（分钟）流动相A（）流动相B（）015 0 100 1545 015 10085,第二节 薄层层析技术,概 述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。,一、原理 基于相同物质在同一的色谱条件下，表现出相同的色谱行为这一基本规律，在同一块薄层板上点加供试品和对照物，在相同条件下展开，显色检出色谱斑点后，将所得供试品与对照物的色谱图进行对比分析，从而对药品进行定性鉴别。,二、特点（一）简便、快速、易普及、具有分离和分析双重功能，且采用共薄层对照分析法，故专属性亦较强。（二）要求做系统适用性试验。(05版药典新增)1.检测灵敏度 2.分离度 3.重复性（三）要求设置对照物,1.检测灵敏度 主要用于限量检查.采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍（10倍）的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一块薄层板上点样、展开、检视，后者应显示清晰的斑点。,系统适用性试验,2.分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，除另有规定外，分离度应大于1.0。,分离度（R）的计算公式为：R=2(d2-d1)/W1+W2 式中 d1为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d2为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1 及W2为相邻两峰各自的峰宽；,3.重复性 主要用于含量测定.即同一供试品溶液在同一块薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差(RSD)应不大于3.0%；需显色后测量的相对标准偏差应不大于5.0%。,对照物分为对照品（主要为有效成分和特征性成分的单体）、对照药材和对照提取物三种。对照物的设置有四种方式：设置一种或数种对照品 设置对照提取物 设置一种或数种对照药材 同时设置对照品和对照药材(“双对照”)，它要求样品色谱图中的主斑点应与对照品和对照药材色谱图中的有关斑点相一致，提高专属性和整体性，可有效地检出药品是否使用了假冒药材.,设置对照物,（四）TLC已广泛用于中药材及其制剂的检验，成为中药鉴别的重要方法和鲜明特色。（五）中国药典大多数品种采用硅胶薄层色谱法，少数使用聚酰胺薄层色谱法和氧化铝色谱法。薄层色谱法还可用于药品的杂质检查和含量测定。,薄层色谱与高效液相色谱的差别（特点）固定相和流动相TLC 流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。而 HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。样品处理TLC要求没有HPLC严格。,色谱分离TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双相多次展开，通常采用正相色谱，色谱后衍生化方便。HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。,对污染物抗受力TLC颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。HPLC 颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。,三、薄层色谱器材及操作,薄层板 1.市售薄层板（亦称预制薄层板）除另有规定外，一般要求使用市售薄层板。市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板两种。常用的有硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。,2.自制薄层板 在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板，除另有规定外，玻板可用10cm10cm、10cm15cm、20cm10cm、20cm20cm不同规格的，最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。其颗粒大小，一般要求直径为1040m。薄层板采用湿法制备，即使用涂布器将制好的固定相糊均匀涂布于玻板上。所用涂布器应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。涂布器有手动、半自动、全自动等类型。,不同规格的薄层板,铺制薄层板,固定相未改性固定相硅胶为使用最广泛的薄层材料氧化铝有碱性、中性、酸性硅藻土为化学中性吸附剂纤维素天然多糖类聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。,表面改性固定相疏水改性硅胶化学键合烷基亲水改性硅胶引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶氨基氰基二羟基 反相）。表面改性纤维素乙酰化纤维素药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一般要求10 40 um。,中药制剂分析中固定相的选择,硅胶G板（可加0.3%0.5%CMC-Na）-多用,氧化铝板 常用于生物碱类药物,聚酰胺板 常用于黄酮类及酚类物质,纤维素板 常用于氨基酸类药物,黏结剂无机黏结剂石膏（硫酸钙），添加石膏的吸附剂以字母“G”表示。没有黏结剂的吸附剂以字母“H”表示。无机黏结剂的优点是：耐高温，耐酸碱，但涂铺薄板动作要快，否则匀浆易凝固。薄层强度差。有机黏结剂羧甲基纤维素钠（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特点是薄层强度高、使用方便，但不能用浓硫酸作显色剂。,荧光黏结剂在吸附剂中添加某种荧光指示剂，常用的荧光指示剂在254nm紫外光下发蓝色荧光的有钠荧光素、硫化镉、阴极绿等。在366nm有荧光的指示剂如彩蓝等。含有荧光指示剂的商品吸附剂以“F”表示，并以下标注明其激发光波长。例 硅胶HF254,载板 玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。,点样器材 为了增强药品定性鉴别的可比性，中国药典规定采用定量点样。最常用的是微升毛细管（定容毛细管），为了提高点样效率和质量，还可用点样辅助设备，如点样支架、半自动或自动点样器。,展开容器 应使用专用的展开缸，展开缸有水平式及直立式两种类型。上行展开一般使用直立展开缸，它又分为平底式和双槽式，双槽展开缸具有节省溶剂、便于预平衡、可控制展开箱内的湿度等优点。展开缸盖子应能密闭，体积应与薄层板大小相适应。不能用生物标本缸等其它玻璃器皿作为展开缸，否则影响展开质量。,全自动点样仪,微升毛细管,双槽展开缸,显色（检视）装置展开后的薄层板，一般需采用相应的显色（检视）方法使板上的被检成分斑点显色。喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的展开缸做为浸渍槽；蒸气熏蒸显色可在双槽展开缸或大小适宜的干燥器中进行；荧光检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光源和相应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍照图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。,喷雾显色,荧光显色,操作方法 一般操作步骤为：薄层板制备（制板）点样展开显色与检视（一）薄层板制备 1.市售薄层板 临用前一般应在110活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。如在贮放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110活化，放干燥器中备用。,2.自制薄层板 除另有规定外，将1份固定相和3份水（或0.20.5羧甲基纤维素钠水溶液）在研钵中向同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布，取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上室温下晾干后，在110烘30分钟1小时活化，立即置干燥器中备用。薄层板一般要求新鲜制备，当天使用。使用前应在反射光及透射光下检查其质量，若板面不均匀、不平整或有麻点、有气泡、有破损及污染等情况，应弃去不用。,（二）点样 1.供试品溶液的制备 主要采用浸渍法、回流以及超声等方法提取，液液萃取法或固液萃取法进行精制。有的成分在药品中是以苷或酯等结合态存在，检验前需水解成游离态再与相应的对照品一同展开分离、鉴别。如万应锭中熊胆的鉴别、定坤丹中人参和三七的鉴别和牛黄上清丸中大黄的鉴别。,要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展,2.原点的点加 除另有规定外，在干燥洁净的环境，用专用毛细管或半自动、自动点样器械点样于薄层板上形成原点。原点一般为圆点状或窄细的条带状。原点基线距板底边1015mm，高效板原点基线离底边810mm。圆点状原点直径一般不大于3mm；条带状的宽度一般为510mm。高效板条带宽度为48mm，原点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般不少于8mm，高效板样品间隔不少于5mm。毛细管接触点样时应少量多次点加，才能保证原点小而圆。还需注意勿损伤薄层表面，点加条带原点时应注意条带的均匀性，用喷雾状条带点样器，可保证点样的质量。,药典规定：点样基线距底边2.0cm,样点直径2-4mm,点间距离约为1.5-2.0cm。,（三）展开 点样后的薄层板放入加有展开剂的展开缸中，密闭，一般采用上行一次展开。薄层板浸入展开剂的深度以液面距原点5mm为宜，薄层板水平倾斜75，溶剂前沿达到规定的展距后，取出薄层板，晾干，待检测。一般上行展开815cm，高效板上行展开58cm。必要时可进行二次展开或双向展开。例如，益气养血口服液中陈皮的薄层鉴别即采用二次展开，先以乙酸乙酯甲醇水吡啶（10017135）展至3cm，取出晾干；再以甲苯乙酸乙酯甲醇水（201011上层）展至8cm，取出晾干。,展开前一般需用展开剂对展开缸进行预平衡，即使缸内展开剂气液两相达到动态平衡，该过程亦称“饱和”。为此可在展开缸内加入适量展开剂，密闭，保持1530分钟。预平衡后，迅速将薄层板放入展开缸中，立即密闭，展开。若薄层板需同时预平衡，可将点样后的薄层板放入双槽展开缸的一侧槽中，另一侧槽中加入展开剂，如上法预平衡后，再将展开剂移入放有薄层板的槽中，展开。展开剂要求新鲜配制，不要多次反复使用。展开剂配制后若分层，则应按要求放置分层后取需要的一相（上层或下层）使用。,展开方式多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。多次展开一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。分步展开混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。,连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。,离心展开薄层板以适当转速旋转时，流动相以适当速率转移到薄层上。该技术主要用于制备色谱。,锲尖技术圆形离心展开具有分辨率高的优点，但需要有一定的仪器装置。采用锲尖技术可以在一般的展开室中进行类似展开。,薄层被刮掉部分,溶剂前沿,（四）显色与检视 1.颜色较深的成分可直接在日光下检视其斑点。2.无色或浅色的成分多用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或再加热使之显色，在日光下检视。3.有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在紫外灯（365nm）下观察荧光色谱。4.有的成分可用试剂的蒸气熏蒸（如碘蒸气、氨蒸气）显色。5.某些无色有紫外吸收且不产生荧光的成分可用荧光淬灭法显色。即在含有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在紫外光灯（254nm）下观察板面上该成分形成的荧光淬灭色谱。,GF254薄层板,GF254薄层板在荧光灯下,荧光淬灭法的GF254薄层板,记录 薄层色谱图象可采用摄像设备拍照，以光学照片或电子图象的形式保存。也可以用扫描仪记录相应的色谱图。,薄层色谱数码相机成像系统,结果判断 供试品色谱中，在与对照品、对照药材或对照提取物色谱的相应的位置上，显相同颜色或荧光的斑点，则判断为符合规定。,四、影响薄层色谱分析的主要因素,1、样品的预处理和供试液的制备,样品：1-12，一捻金；13，人参二醇（上），人参三醇（下）,稀酸水解后直接用氯仿提取，有大黄的干扰,经碱性氧化铝柱净化,2.吸附剂的活性和相对湿度,样品：1-2，赤芍；3-4，白芍,3.溶剂蒸气,图 15.预平衡,图 16.不预平衡,图15样品：1-5.人参；6.西洋参；7.人参皂苷对照品图16样品：1-2人参；3.西洋参,4.温度,25 下人参药材薄层色谱图,10 下人参药材薄层色谱图,5.其他因素,应用实例（一）六味地黄丸中牡丹皮的鉴别,1.丹皮酚；25.六味地黄丸,112.一捻金；13.人参二醇+人参三醇,（二）一捻金中人参的鉴别,（三）龟龄集中人参的鉴别,14.龟龄集；5.人参对照药材；6.人参皂苷Rb1(S1)、Re(S2)、Rg1(S3),（四）万氏牛黄清心丸中黄连的鉴别,15.万氏牛黄清心丸；6.黄连对照药材；7.小檗碱,（五）华佗再造丸薄层色谱图,（喷显色剂前的）,（喷显色剂后的）,1、12.吴茱萸对照药材；2、11.川芎对照药材；310.华佗再造丸,To control active compounds(alkaloids)by TLC fingerprints,I,伊贝母药材薄层色谱图 1、2阴性对照 3.西贝素甙对照品 4.西贝素对照品 5.样品990120yc 6.样品990406yc 7.样品990918yc 8、9伊贝母药材对照:展开系统为乙酸乙酯：丙酮：甲酸：水（5：3：0.5：1）：展开系统为氯仿-甲醇-水（40：10：1）,例6,人工牛黄的鉴别 取本品，剪碎，加硅藻土0.6g，研匀，加氯仿10ml、冰醋酸0.5ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。胆酸和猪去氧胆酸加乙醇制成1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。,例7,TLC法 CMC-Na，硅胶G展开剂 醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（32:6:1:1）显色剂 10%磷钼酸乙醇液，1100C，10min,人工牛黄,供试品,牛黄空白,猪去氧胆酸,胆酸,黄芩的鉴别 供试品溶液的制备：取本品3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研匀，加甲醇20ml，加热回流1hr，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：黄芩甙对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。,例8,TLC法 CMC-Na，硅胶G（4%醋酸钠）展开剂 醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:3:1:1）显色剂 2%三氯化铁乙醇液,使斑点更为集中,-OH与Fe+3络合,黄芩甙,供试品,黄芩空白,栀子的鉴别 供试品溶液的制备：取本品3g，加乙醚15ml，研磨，弃去乙醚。残渣挥干乙醚，加醋酸乙酯30ml，加热回流1hr,放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3ml溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：栀子甙对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。,例9,TLC法 CMC-Na，硅胶G展开剂 醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10:7:2:0.5）显色剂 10%硫酸乙醇 1050C,10min,栀子甙,供试品,栀子空白,黄连的鉴别 供试品溶液的制备：取含量测定项下剩余的盐酸-甲醇提取液4ml，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，使成1ml作为供试品溶液。,例10,对照药材溶液的制备：黄连对照药材50mg，加甲醇10ml，回流加热15min,滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。对照品溶液的制备：再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含 0.5mg的溶液，作为对照品溶液。,TLC法 硅胶G CMC-Na展开剂 苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（12:6:3:3:1）显色剂 UV（365nm）,公式品,薄层色谱参数,保留参数（Rf值）用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。Rf=Ls/L。,原点,R,W,Ls,Lr,L。,S,原点,参比,样品,前沿,注意：同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n。相对比移值（Rx）Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。Rx=Ls/Lr,流动相与展开体系,液-固吸附 在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：,溶解能力,相互作用,液-液分配基于组分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际上在TLC中，分配与吸附是并存的（大气中水分也是一种固定相）。此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。,流动相选择时需考虑溶剂的下列情况一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。,固定相的活度及其调节 在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。预吸附还可能影响Rf在0.6-1.0之间的斑点的分离。,在层析过程中发生的边缘效应就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。,END!,