Hb的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳课件.ppt
实验四 血红蛋白的醋酸纤维薄膜电泳与血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳,血红蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的（Experimental Objectives）：,1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作2.了解血红蛋白的组成及分类,二、实验原理(Experimental Principles),蛋白质离子在电场的作用下，可向着与其电性相反的电极移动。由于各种蛋白质pI不同，在同一pH环境中所带电荷量也不同，同时分子大小形状各有差异，所以在同一电场中泳动速度不同。一般来说，所带的电荷多而颗粒小者，泳动速度快，反之则慢。据此，可用电泳法将血清中的各种蛋白质加以分离。,三、实验材料、主要仪器和试剂（Equipments,Materials and Agents）,（一）试剂0.9%的NaCl溶液；四氯化碳；TEB缓冲液（pH8.6）；硼酸-氢氧化钠缓冲液（pH8.6）；丽春红染液；漂洗液。（二）实验器材醋酸纤维薄膜；培养皿；滤纸；镊子；玻璃板；电泳仪。,四、操作步骤（Operating Procedure）,1.取血：用2%碘酒棉球消毒手指，再用75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约0.05ml放入1.5ml离心管中，并轻轻摇匀。2.制备Hb液：1）洗涤红细胞：加0.9%NaCl 1ml于上述离心管中，颠倒混匀5-6次，4000rpm，离心3分钟。弃上清，再加1ml 0.9%NaCl重悬，相同条件重复离心一次。2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1滴，摇匀，再加入四氯化碳1滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得Hb液。,3.电泳1）膜条准备：2）点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余液体，然后平铺在玻璃板上（毛面朝上），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘1.5cm左右。,3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，纱布条浸润膜条搭成滤纸条并盖严电泳室。通电先预电泳5-10min。调节电压为150V，电泳时间约为25 分钟。4）染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中染色10 分钟。4.漂洗：取出染色膜条并移至漂洗液中漂洗至蛋白底色脱净，观察色带清晰的电泳图谱并分析结果。,五、结果与分析：（Results and Analysis）,观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深浅。,六、思考题：(Questions)电泳分离蛋白质的原理是什么？出现异常血红蛋白的临床意义是什么？,血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳,一、实验目的（Experimental Objectives）：1.掌握血清脂蛋白测定的临床意义;2.了解血清脂蛋白电泳的基本原理及操作方法。,二、实验原理(Experimental Principles)：,血清中的脂类物质以不同的比例与载脂蛋白结合成脂蛋白。在pH较大的缓冲液中，脂蛋白带负电荷，在电场中向正极泳动。各种脂蛋白因其所带的负电荷量及颗粒大小、形状等不同，在电场中的泳动速度也不一样，故可将其分离，用不同方法显色便可进行定性、定量分析。用琼脂糖凝胶作支持物进行电泳，先将血清用脂类染料（苏丹黑B或油红O）预染，使脂蛋白着色，经电泳后可将血清脂蛋白分成三条清晰的区带，可用光密度计扫描定量，亦可将各脂蛋白区带切下，进行比色定量。,三、主要设备、实验材料和试剂（Equipments,Materials and Agents）,（一）试剂巴比妥缓冲液（pH8.6 I=0.075）；制胶缓冲液（pH8.6 I=0.05）；0.45%琼脂糖凝胶；苏丹黑B染色液：制胶缓冲液（pH8.6 I=0.05）（二）设备 电泳仪和电泳槽；普通离心机；水浴箱；微量加样器、载玻片等,四、操作步骤（Operating Procedure）,1预染血清：取Eppendof 管一支，加入血清0.2ml及苏丹黑B染料液0.02ml，混匀后置于37C水浴中预染30分钟，2000rpm离心5分钟，取上清液备用。2.制备琼脂糖胶板：将0.45%的琼脂糖凝胶水浴煮沸溶解后，用吸管吸取凝胶溶液均匀铺于载玻片上，每片约2.5ml，趁热将长为15mm的硬纸片插在与载玻片短边平行相近2cm处的凝胶中，静置约半小时后凝固。此时小心将纸片取出，凝胶板上出现一小凹槽。,3.点样：用微量加样器吸取预染血清约15l，注入上述凹槽内。4.电泳：将点样的凝胶板平行放于电泳槽中，点样端置于负极。用浸泡了电极缓冲液的纱布搭桥，使凝胶板两端与电泳槽缓冲液相连。平衡3-5分钟。接通电源，调电压100V，约45分钟，观察到分开的电泳条带后关闭电源，取出凝胶板观察结果。,五、结果与分析（Results and Analysis）,肉眼观察各区带的颜色深浅宽窄及其排列顺序，绘图纪录之。1.计算2.临床意义：1.正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从正极到负极依次为-脂蛋白、前-脂蛋白和-脂蛋白，原点处应无乳糜微粒。2.正常参考值：-脂蛋白=25.74.1%前-脂蛋白=214.4%-脂蛋白=53.35.3%,CM,六.思考题(Questions),电泳时点样端置于哪一极，为什么？血浆脂蛋白的分类、组成以及生理功能。,
