人教版生物选修一专题5《DNA和蛋白质技术》课件.ppt
专题5 DNA和蛋白质技术,DNA的粗提取与鉴定,课题1,一、基础知识,1、DNA粗提取的原理,（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓 度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为 0.14 molL时,DNA的溶解度最低。,（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精溶液。,：DNA的溶解性和耐受性,（3）蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而 DNA在80C以上才会变性。洗涤剂可以瓦解 细胞膜，但对DNA没有影响。,2、DNA的鉴定原理：,在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,注意:二苯胺要现配现用,否则会影响鉴定结果。,二、实验设计,1、实验材料的选取,原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,2、破碎细胞，获取含DNA的滤液,在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。,血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。,注意：,高中生物,3、去除滤液中的杂质,方案一原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方法：用NaCl反复溶解和析出DNA。方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方法：加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）。方案三原理：蛋白质和DNA的变性温度不同。方法：将滤液放在6075的恒温水浴箱中。,（三个方案）,高中生物,4、DNA析出与鉴定,试管2支，编号甲乙各加5mL2mol/L的NaCl溶液甲中放入少量白色丝状物，使之溶解各加4mL二苯胺，混合均匀沸水浴5min观察颜色变化,滤液与等体积的冷却酒精（体积分数95%）混合均匀，静置23分钟，析出的白色丝状物就是DNA。,析出：,鉴定：,多聚酶链式反应扩增DNA片段,课题2,高中生物,一、基础知识,高中生物,1、PCR原理：,与细胞内DNA复制类似,高中生物,在PCR技术中：,扩增方向：DNA的合成方向总是从子链的5端 向3端延伸。,解旋：利用了DNA的热变性原理，通过控制温 度来控制双链的解聚与结合。,酶:耐高温的TaqDNA聚合酶，高温不会失活。,条件：一定的缓冲溶液下才能进行，需提供DNA 模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热 的DNA聚合酶，同时要控制温度。,高中生物,2、PCR的反应过程：,每个循环包括：变性 复性延伸,要经历三十多次循环,变性（模板DNA解旋）,模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。,复性（退火）,模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,延伸,DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。,高中生物,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,准备好PCR反应体系的配方,用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分,盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液,离心10s,将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应,二、实验步骤：,高中生物,高中生物,三、结果分析与评价,1、反应液稀释：取2LPCR反应液，添加98L蒸馏水；2、分光光度计调零：将100L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm 处将分光光度计调整读数为零。3、测定：将100L反应稀释液倒入比色杯中，测 定在260nm处的光吸收值。4、计算：DNA含量50光吸收值稀释倍数,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,血红蛋白的提取和分离,课题3,高中生物,一、基础知识：,高中生物,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,2、概念：,高中生物,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。,3、原理：,4、具体过程：,高中生物,（二）缓冲溶液：,高中生物,抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。,1、原理：,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等）。,2、配制：,调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。,3、作用：,高中生物,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,1、原理：,不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,(三)电泳：,指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,高中生物,2、分离方法：,3、分离过程：,二、实验操作实验步骤,高中生物,血液组成成分,阅读思考：血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白,两个a肽链,两个一肽链,高中生物,血液组成成分:,1、样品处理,高中生物,（1）红细胞的洗涤,除去血浆蛋白等杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。,血液100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,高中生物,（2）血红蛋白的释放：,在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,(3)分离血红蛋白,分离过程,红细胞混合液,高中生物,(4)透析：,在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。,pH7的磷酸缓冲液维持血红蛋白的正常特性。缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分子充分地向外扩散。,高中生物,2、粗分离,高中生物,3、纯化,（1）凝胶色谱柱的制作：,（2）凝胶色谱柱的装填：,教材图519,（3)样品的加入和洗脱,-透析除去分子较小的杂质,-凝胶色谱操作,材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:,（2）凝胶色谱柱的装填：,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,高中生物,(3)样品的加入和洗脱,基本过程：调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质,高中生物,注意：正确的加样操作,1、不要触及破坏凝胶面,2、贴壁加样,3、使吸管管口沿管壁环绕移动,高中生物,4、纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,高中生物,红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,注意事项：,高中生物,作业 名师一号,谢谢合作！,高中生物,
