SHMT基因工程菌的构建及高效表达.doc

S HMT 基因工程菌的构建及高效表达蔡宇日易吴梧桐史燕东( 中国药科大学生物技术中心 南京 210009)摘 要 以质粒 p T727 和 pB R322 为载体 ,构建 GlyA 基因的重组质粒 ,继而得到 12 株基因工程菌 ( CWS 系列) 。其中 ,高表达菌株 CWS27 的 SHM T 酶表达量占全菌可溶蛋白的 47 % ,是其宿 主菌的 56 倍 ;改善培养条件后 ,CWS27 中 SHM T 酶活力可达宿主菌的 106 倍 。关键词GlyA ,丝氨酸羟甲基转移酶 ,CWS27目前 ,L2丝氨酸价格昂贵 ,大部分只限用于氨基酸输液和高级化妆品 。如果能大幅度降低其生产成本 ,并作为生产 L2色氨酸 、L2多巴 、L2半胱氨酸的前体 ,L2丝氨酸将会有极 大的市场和效益1 。GlyA 基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶 ( Serine Hydro xy2met hylt rans2ferase , SHM T) 能利用廉价的甘氨酸和甲醛生产 L2丝氨酸 ,很有应用价值 。Hamilto n 等已成功地运用鸟枪法克隆并构建了 SHM T 基因工程菌 ,用于工业生产 ,L2丝氨酸产率高 于 400g/ L 2 。我们运用 PCR 技术 ,成功地从大肠杆菌中扩增出 GlyA 目的基因3 ,并拼接入质粒p T727 、pB R322 ,转化 8 株大肠杆菌 ,得到 12 株 SHM T 基因工程菌 , 命名为 CWS 系列 。其中 CWS27 的 SHM T 酶活是其宿主菌的 56 倍 , SHM T 表达量约占全菌蛋白的 47 % ,可达 180g/ ml 。同时 ,我们摸索了 CWS27 的最佳培养时间 、合理的 p H 范围及较适合的培 养基 ,使 CWS27 中 SHM T 的酶活提高到其宿主菌的 106 倍 。1 材料和方法111菌种 、质粒 、工具酶及培养基宿主菌 E. col i 均 购 自 中 科 院 菌 种 保 藏 中 心 ; p T727 来 自 Harvard Medical School ; pB R322 和限制性核酸酶均购自 Bio2L ab 公司 ;低分子量标准蛋白质购自中国科学院生物 化学研究所东风生化试剂厂 。质粒的抽提 、转化以及酶切 、酶连反应参见文献 4 。基因 工程菌的构建均采用 LB 培养基 。112S HMT 酶活测定SHM T 酶活测定的原理是 :它可催化 DL2苯基丝氨酸分解产生苯甲醛 ,后者在 279 nm处有特 征 性 的 强 烈 吸 收 。按 1 ml 湿 菌/ 1 ml 底 物 溶 液 ( 50 mmol/ L DL2苯 基 丝 氨 酸 ,50mol/ L 磷酸吡哆醛 ,0103 %十六烷基三甲基溴化铵5 ) 制备反应液 ,在 30 振荡反应本文于 1995 年 2 月 16 日收到 。1 h ,以 5000r/ min 转速离心反应液 10 min ,取上清 ,测定 A279 值 ,根据 A279 苯甲醛浓度回归方程确定反应液中苯甲醛浓度 。酶活定义 : 在 30 的 1L 底物溶液中 ,1g 湿菌反应 1 h产生 1 mol 苯甲醛为 1 个酶活单位 ( u) 。113全菌蛋白电泳和基因表达率的测定SDS2PA GE 方法参见文献 4 。按 2 %3 %的接菌量接菌于 LB 培养基 ,37 振荡过 夜 ,测 OD600值 。取 1 ml 菌液 ,离心去上清 ,按每 011 OD600 菌量加 50l 双蒸水和 50l 2 × 上样缓冲液的比例稀释 ,从中取 20l 或 30l 上样 ,分离胶浓度为 15 % 。薄层扫描采用双 波长 (1 :590 nm ,2 :500 nm) 。结果与讨论重组质粒的构建2211图 1 重组质粒的构建Flow diagram of plasmid reco mbinatio nFig. 1工程菌及宿主菌的酶活比较由图 2 可见 :所有含 p T7272GlyA 的工程菌的 SHM T 酶活都要比其宿主菌的酶活低 , 而含 pB R3222GlyA 的工程菌的酶活都或多或少比宿主菌高 ,其中 CWS27 的 SHM T 酶活 是其宿主菌的 56 倍 ,CWS212 是其宿主菌的 23 倍 。212图 2 不同菌种 SHM T 酶活比较 (10 克湿菌)Fig. 2 Co mpariso n of Enzyme SHM T Activity of DifferentBacteria (Activit y of Enzyme of 10g Wet Bacteria)1 :AS. 1 . 1187 ;2 :AS. 1 . 1187 + p T7272GlyA ,CWS21 ;3 :AS. 1 . 1187 + pBR322 - GlyA ,CWS22 ;4 :AS. 1 . 1189 ;5 :AS. 1 . 1189 + p T7272GlyA ,CWS23 ;6 :AS. 1 . 1189 + pBR322 - GlyA ,CWS24 ;7 :AS. 1 . 1192 ;8 :AS. 1 . 1192 + p T7272GlyA ,CWS25 ;9 :AS. 1 . 1192 + pBR322 - GlyA ,CWS26 ;10 :AS. 1 . 1193 ;11 :AS. 1 . 1193 + pBR322 - GlyA ,CWS27 ;12 :BL 21 ;13 :BL 21 + p T7272GlyA ,CWS28 ;14 :J M105 ;15 :J M105 + p T7272GlyA ,CWS29 ;16 :J M105 + pBR322 - GlyA ,CWS210 ;17 :AS. 1 . 1199 ;18 :AS. 1 . 1199 + p T7272GlyA ,CWS211 ;19 :AS. 1 . 1199 + pBR322 - GlyA ,CWS212 .我们通过 PCR 技术克隆的 GlyA 基因拥有自己的调控序列 ,包括 : a) 235 regio n ; b) Pribnow bo x ; c) SD 序列 ; d) Met R 结合位点 (正调控位点) ;e) PruR 结合位点 ( 负调控 位点) ; f ) E. col i RNA 聚合酶的结合位点 ;e) 在编码序列后有四对颈环结构6 。因此它 可以不要额外的调控序列 , 而完成自身的表达 。这就是 GlyA 基因 在 插 入 非 表 达 质 粒 pB R322 后仍能得到高表达的原因 。也正是因为在 GlyA 基因的编码序列前有大约 300bp 的调控序列 ,p T727 中的 T7 强启动子无法发挥其正常的功能 ; 同时少量的 T7 RNA 聚合 酶便有很强的竞争力 ,能大大抑制由 E. col i 的 RNA 聚合酶所操纵转录 ,而且 T7 RNA 聚合酶对其自身的启动子有高度的选择性 ,即便是拼入 p T7272GlyA 中的 E. col i 启动序 列也不能利用7 。我们认为这就是含 p T7272GlyA 基因工程菌的 SHM T 酶活比其宿主菌 还要低的原因 。213CWS27 中 S HMT 酶的表达量 8按 112 所述 ,做 SDS2PA GE 电泳 ,结果见图 3 ,4 。根据参考文献 9 ,SHM T的分子量应该是 46 ,500 ,与我们的结果相符9 。分别对图 3 的 c 、e 和图 4 的 e 进行薄层扫描 ,结果(图谱略) 显示 ,CWS27 中 SHM T 酶表达量占全菌可溶性蛋白的 47 % ( 3c : 49 % ,3e : 45 % ,4e :46 % ,取算术平均值) 。请专家估算 ,图 4 ( b) 中 SHM T 约含 6g ,以发酵液 OD600 值为016 计算 ,SHM T 酶量可达 180g/ ml 。图 3 CWS27 不同浓度梯度的 SDS2PA GE 电泳图Fig. 3 SDS2PA GE : Different Co ncent ratio n of CWS27 a) 51 ; b) 101 ;c) 201 ; d) 301 ;e) 401 .图 4 SDS2PA GE 电泳图Fig. 4 SDS2PA GE.a) As. 1 . 1193 201 ; b) CWS27 ,201 ; c) Mar ker ;d) AS. 1 . 1193 301 ;e) CWS27 ,301 .214量佳培养条件初探我们对 CWS27 的培养条件作了一些改善 , 如 : 选择最佳的培养时间 、最佳 p H 区间 等 。由图 5 、6 和 7 可见 :最佳的发酵培养时间是 14 h ,较理想的 p H 范围为 712718 、814912 ,在所选用的 17 号培养基中 ,4 号最理想 。我们选择 4 号培养基 ,在 p H714 条件 下发酵 14 h ,CWS27 的 SHM T 酶活可达到宿主菌的 106 倍 ,而且 4 号培养基价格较低 ,可图 5 培养时间对酶活的影响图 6 培养基 p H 值对酶活的影响Fig. 5 Different cult rue time (activit y of enzyme of 10g wet bacteria)2 2 Activit y of SHM T enzyme2 2 Yield of bacteriaFig. 6Different p H of cult ure medium (activit y of enzyme of 10g wet bacteria)2 2 Activit y of SHM T enzyme2 2 Yield of bacteria图 7不同培养基对酶活的影响(以 10 克湿菌为比较对象)Fig. 7 Different cult rue medium (activit y of enzyme of 10g wet bacteria)1 ,2 : U se medium No . 1 (LB medium) ; 3 ,4 : U se medium No . 2 ( Ino rganic Salt s) ;5 ,6 : U se medium No . 3 (ino rganic salt s) 7 ,8 : U se medium No . 4 (lacto se etc . ) ;9 ,10 : U se medium No . 5 ( beef ext ract ) ; 11 ,12 : U se medium No . 6 (lacto se) ;13 ,14 : U se medium No . 7 ( beef ext ract ) .Yield of bacteria ( g/ L ) ,Activit y of SHM T enzyme ( u)参考文献1 张炳荣编译 1 氨基酸工业大全 技术与市场 1 北京 :轻工业出版社 ,199112 Hamilto n B K , Hsiao H Y , Swann W E. Trends in Biotechnolo gy ,1985 , 3 ( 3) :646813 蔡宇 ,吴梧桐 ,史燕东 1 药物生物技术 ,1995 ,2 ( 1) :1414 Sambroo k J , Frit sch E F , Maniatis. Molecular Clo nin g a labo rato ry manual , seco nd editio n ,198915 Hsiao H Y , Wei T , Cam p bell K. Biotechnology and bioengineering , 1986 ,28 :85786716 Stauffer J V , Plamann M D , Stauffer L T. Gene , 1981 , 14 :637217 St udier F W , Moffat t B A. J Mol Biol , 1986 , 189 :11313018 Steiert J G , Rolfes R J , Stauffer G V . J . Bacteriol , 1990 , 172 ( 7) :3799380819 Plamann M D , Stauffer G V . Gene , 1983 , 22 :9181Construct ion and High2rate Expression of S HMT Genet ic BacteriaCai YuyangWu Wuto ngShi Yando ng( Center of B iotech nology , Chi na Phar m aceut ical U ni versity ,N anji ng , 210009)AbstractWe used p T727 and pBR322 as vectors of GlyA gene amplicated by PCR. Wit h which we co nst ructed 12 st rains of genetic bacteria named CWS. Amo ng t he total dissoluble p roteins of CWS27 , SHM T is 47 % , which is 56 times as high as it s hosts. By imp roving cult ure co nditio ns , t he ac2tivit y of SHM T in CWS27 could reach to 106 times as high as it s hosts.Key wordsGlyA gene , serine hydro xymet hylt ransferase , CWS27征稿通知由中国微生 物 学 会 和 中 国 药 学 会 联 合 主 办 的 第 十 次 国 际 放 线 菌 生 物 学 学 术 会 议 ( Internatio nalSymposium o n Biology of Actino mycetes) 将于 1997 年 5 月 27 日至 30 日在北京中国科技会堂举行 。这是 反映当今全世界放线菌领域内最高水平的学术会议 。为了使我国放线菌的研究 、应用和开发成果能在国际会议上得到充分的反映 ,使国际学术界更多了 解我国的有关研究 ,我们欢迎从事有关工作的科学工作者踊跃参加 。有关投稿的要求如下 :一 、投稿内容 :请见二轮通知 。通知可向会议秘书处索取 。二 、投稿要求 :凡未公开发表的有关内容均可投送 。要求投送英文摘要一份 。经会议秘书处审定接 受后打印在二轮通知的稿件表格中 。三 、投稿截止日期 :1997 年 1 月 31 日 。 中国微生物学会的通讯处是 :北京中关村北一条 13 号中国科学院微生物研究所内 ( 邮编100080) 电话 : 010 - 62554677 ;传 真 :010 - 62554677电子信箱 :chenggs sun. im. ac. cn第十次国际放线菌生物学术会议