（生物化学教学ppt课件）第13章 rna的生物合成.ppt

第十三 章,RNA的生物合成(转录),RNA Biosynthesis(Transcription),下午3时31分,1,生物化学与分子生物学 江黎明,在生物界，RNA生物合成有两种方式：,DNA指导的RNA合成，也称为转录(transcription)。是生物体内RNA的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。,RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也称RNA复制(RNA replication)，是逆转录病毒以外的RNA病毒,在宿主细胞以病毒单链RNA为模板合成RNA的方式。,下午3时31分,2,是指生物体以DNA为模板合成RNA的过程。意指将DNA碱基序列转抄为RNA碱基序列。,转录的概念,参与的物质,底物：NTP(ATP、UTP、GTP、CTP),模板：DNA（结构基因模板链）,酶：依赖DNA的RNA聚合酶,简称RNA聚合酶(RNA polymerase,RNA-pol；不需引物),其他：蛋白质因子、Mg2+、Mn2+,3,下午3时31分,表13-1 转录与DNA复制的异同点,下午3时31分,4,第一节,RNA合成中的模板和酶,Template and Enzymes in RNA Biosynthesis,下午3时31分,5,学习要求：,掌握复制与转录的主要区别；转录、不对称转录、模板链、编码链的概念；原核生物 RNA 聚合酶全酶、核心酶的组成和作用；真核生物 RNA 聚合酶的主要类型和产物，转录因子的概念。,一、转录模板,1.结构基因(structural gene):,编码链(coding strand),能转录出RNA(mRNA、rRNA和tRNA)的DNA区段。人类基因组编码蛋白质的基因约为22.5万个，但通常只有2%15%的基因处于转录活性状态。,模板链(template strand),是指在转录过程中，能够按碱基配对规律指导RNA合成的那股DNA单链，也称为反义链或Watson链。,是指与模板链对应的不被转录的那股DNA单链，也称作有意义链或Crick链。,下午3时31分,6,5GCA GTA CAT GTC33cgt cat gta cag5,5GCA GUA CAU GUC3,mRNA,NAla Val His ValC,多肽链,转录,翻译,编码链/有意义链/Crick链,模板链/反义链/Watson链,图13-2 基因的遗传信息传递,DNA双链,下午3时31分,7,2.不对称转录(asymmetric transcription):,在不同的DNA 转录区段中，模板链并非总在同一股DNA链上。,在一个DNA转录区段中，只有模板链被转录，而编码链不转录；,图13-1 RNA 的不对称转录,下午3时31分,8,(DNA dependent RNA polymerase,RNA pol),二、RNA聚合酶,即依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP),也称转录酶(transcriptase)。,以结构基因反义链作为模板；,不需要引物就能直接启动RNA链的延长。,下午3时31分,9,原核生物(E.Coli)RNA pol 由2共5种(6个)亚基组成。,（一）原核生物的RNA聚合酶,下午3时31分,10,表13-2 大肠杆菌(EColi)RNA 聚合酶各亚基的功能,下午3时31分,11,P,S1,S2,S3,启动子,O,(Promoter),调控序列,结构基因,操纵子,结合RNA聚合酶,表达功能蛋白,?,CAP结合位点,（二）原核生物RNA聚合酶与模板的辨认结合,操纵子(operon)：原核生物转录的基本单位。,下午3时31分,12,RNA聚合酶保护法,先把一段基因分离出来后，与提纯的RNA聚合酶混合;,加入核酸外切酶作用一定时间;,总有一段4060 bp的DNA片段由于RNA聚合酶的结合而免于被降解。,对这段受保护的DNA序列进行分析。,下午3时31分,13,图13-4 RNA聚合酶保护法分析启动子序列,下午3时31分,14,Pribnow盒(Pribnow box),转录起点的上游约-10处找到6bp的保守序列TATAAT，称为-10序列或Pribnow盒(box)；与真核细胞和古生菌中的TATA Box功能相似。,T A T A A T 80%95%45%60%50%96%,该序列AT丰富，易于解链。其功能是:,RNA pol(RNA 聚合酶)紧密结合；形成开放启动复合体；使RNA pol定向转录,-10序列的突变不影响RNApol与启动子的结合速度，可是会降低双链解开的速度。,下午3时31分,15,因子具有辨认转录起始位点的作用。已发现大肠杆菌有多种 因子，如70、60、32、54、28和24等。,70(相对分子质量70,000)识别、结合典型启动子位点；,32(相对分子质量32,000)识别、结合热激蛋白（heat shock protein，Hsp）基因转录启动子。,60(相对分子质量60,000)在氮饥饿时开启某些可利用其他氮源的基因。,下午3时31分,16,表13-3 真核生物RNA 聚合酶的种类与性质,1 45S rRNA是5.8S、18S和28S rRNA的前体。,2 hnRNA是mRNA的前体。,37 具有重要的基因表达调节作用的非编码RNA。,鬼笔鹅膏蕈,（三）真核生物的RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶、亚基的功能,50 kD中亚基 1 亚基,小亚基(10)/(7)/(11)亚基(识别起始点),类 型 数目/每个酶 对应于原核功能,128 kD大亚基 2 和 亚基(催化),3种pol的大亚基C末端aa序列均为(YSPTSPS)n;,n=20-60,与种属有关,称羧基末端结构域(CTD);,含带羟基的Y(酪)S(丝)T(苏),可被磷酸化;,pol的磷酸化在从转录起始过渡到延长中起重要作用。,下午3时31分,18,第二节,The Process of Transcription in Prokaryote,原核生物RNA合成过程,下午3时31分,19,学习要求：,熟悉原核生物 RNA 聚合酶与模板辨认结合；原核转录起始、延长和两类转录终止过程的特点。了解-35区、-10区、上游、下游等概念。,起始(initiation)：需RNA聚合酶全酶,原核生物RNA聚合酶可直接与模板DNA结合启动转录。,延长(elongation)：仅需核心酶催化,终止(termination)：,依赖因子的转录终止机制；非依赖因子的转录终止机制。,下午3时31分,20,转录过程可分为三个阶段：,一、转录起始,图13-5 原核生物转录的起始,RNA 聚合酶()结合到DNA的启动子上而启动转录。,下午3时31分,21,转录起始的基本过程,启动子复合物promoter complex),闭合启动子复合物(closed promoter complex),开放启动子复合物(open promoter complex),转录起始复合物(RNA聚合酶-DNA-pppG-pN-OH),向下移动到-10区TATA盒跨入转录起始点,启动子的-10区局部解链,RNA链5端头两个核苷酸产生3,5-磷酸二酯键,因子脱落。,因子辨认启动子-35序列RNA聚合酶结合到启动子上,下午3时31分,22,二、转录延长,因子从转录起始复合物上的脱落，导致RNA聚合酶构象随之发生改变，使核心酶沿着模板链的35方向滑行。,核心酶向下游滑动时，双链DNA边解旋边解链；同时，核心酶按照碱基配对规律，不断使NTPs在5-pppGpN-OH的3端羟基上逐个聚合。,下午3时31分,23,核心酶在DNA上覆盖区段为4060 bp，产物RNA链与模板链形成长约89 bp的RNA/DNA杂交双链；由核心酶-DNA-RNA形成的转录复合物称为转录空泡(transcription bubble)。,碱基配对的稳定性是GCATAU；RNA/DNA杂交结构不及DNADNA 双链稳定。,下午3时31分,24,转录延长与蛋白质合成同时进行。,同一DNA模板上有多个转录同时在进行；,原核生物转录的特点：,下午3时31分,25,图13-7电子显微镜下原核生物的羽毛状转录现象,下午3时31分,26,三、转录终止,因子,1.识别结合富含C的RNA区,功能,3.ATPase活性,2.解螺旋酶活性,1969年Roberts在T4噬菌体感染Ecoli的研究中首次发现了能控制转录终止的蛋白质，命名为Rho()因子。,六聚体蛋白,下午3时31分,27,（一）依赖因子的转录终止,因子识别结合RNA富含C区使RNA pol变构停顿；,ATPase活性水解ATP释能使产物RNA释放。,解螺旋酶活性使RNA/DNA杂交双链解离；,下午3时31分,28,DNA模板转录终止区有富含GC的反向重复序列，以及其后出现的68个连续的A；,（二）非依赖因子的转录终止,下午3时31分,29,转录的RNA区段会形成特殊的茎环结构和随后的多个连续的U使转录终止。,位于核心酶覆盖区域内形成的RNA茎-环结构可导致核心酶构象变化，阻止转录向下游推进。,RNA茎-环结构之后多个连续U所形成的AU配对最不稳定，促使RNA/DNA解链脱落。,图13-9 原核生物非依赖因子转录终止模式,下午3时31分,30,Transcription is DNA directed RNA synthesis,catalyzed by enzyme RNA polymerase.The DNA double helix must on line to expose its template strand,so RNA polymerase can add the right ribonucleotide triphosphate monomer to the growing RNA transcript.RNA polymerase read the template strand from 3 prime to 5 prime end,and the RNA transcript grows from its own 5 prime to 3 prime end.The DNA double helix extends rewind.When the RNA polymerase reaches the end of the template region,the enzyme and new transcript are released.,原核生物的转录过程,下午3时31分,31,真核生物的转录过程,第三节,The Process of Transcription in Eukaryote,下午3时31分,32,学习要求：,熟悉真核转录因子，转录前起始复合物和真核转录的三个阶段。,一、mRNA的合成,顺式作用元件(cis-acting element),（一）转录起始,1.转录起始点的上游区段,指存在真核生物基因转录起始点上游，与转录有关的各种序列；即在同一DNA分子上具有可影响或调控转录的各种片段。,图13-10 真核生物RNA聚合酶识别的启动子区序列*Y表示嘌呤脱氧核苷酸,下午3时31分,33,由其它基因编码，能直接或间接识别和结合启动子及其上游调节序列等顺式作用元件或RNA聚合酶的蛋白质。,反式作用因子(trans-acting factor)：,2.转录因子(transcriptional factor,TF),转录因子(transcriptional factor，TF):,一般指能直接或间接识别和结合RNA聚合酶，介导RNA聚合酶与启动子相互作用的反式作用因子。,下午3时31分,34,转录因子有很多种类，相对应于RNA聚合酶、和的TF，分别称为TF、TF和TF。,TF又可分为TF A、TFB、TF等。,大多含有锌指、螺旋-转角-螺旋等模体；可与RNA-pol和DNA组成RNA-pol-蛋白质-DNA复合物启动转录。,某些TF或其亚基(TF F小亚基)与原核生物因子在序列上有不同程度的一致性。,转录因子的种类：,转录因子的结构：,转录因子的种类和结构特点：,下午3时31分,35,真核生物RNA聚合酶的种类及其相应的启动子和转录因子,1 45S rRNA是5.8S、18S和28S rRNA的前体。,2 hnRNA是mRNA的前体。,37 具有重要的基因表达调节作用的非编码RNA。,1 TBP：TATA binding protein(TATA 结合蛋白)；2 TAF：TBP associated factor(TBP相关因子)；3 CTD：Carboxyl Terminal Domain(RNA聚合酶大亚基羧基末端结构域)。,表13-3 真核生物转录因子（TF）的种类及其功能,通用转录因子(general transcription factor)：,指能直接与RNA聚合酶相互作用，介导RNA聚合酶与启动子结合的转录因子，如TFD。,TFD,人类细胞中至少有12种不同的TAF。,不同TAF与TBP的组合对不同启动子的亲和力不同；可选择性活化不同基因启动子。,TBP可结合10 bpDNA区段，刚好覆盖TATA盒(TFD可覆盖35 bp或更长的区域)。,TBP,810个TAF,下午3时31分,38,3.转录前起始复合物,与原核生物RNA聚合酶靠 因子辨认结合启动子而启动转录不同，真核生物RNA聚合酶需要依靠众多转录因子的帮助才能与DNA结合。,(pre-initiation complex,PIC),在起始阶段，RNA聚合酶在一系列TF的参与下形成转录前起始复合物。,下午3时31分,39,TFA,TFB,TFH,TFE,1.TFD-A-B-DNA复合物的形成；,TATA,2.PIC组装完成，生成第一个磷酸二酯键；,TBP,TAF,RNA POL-,TAF,TAF,图13-11 RNA-pol 催化转录的前起始复合物的形成,3.TFH使CTD磷酸化，聚合酶向下游移动。,4.拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。,转录因子之间相互作用、结合，形成专一性的活性复合物，再与RNA-pol搭配而特异性地结合并转录相应的基因。,上游因子、可诱导因子及它们相应的反式作用因子也有相类似的作用规律。,下午3时31分,41,（二）转录延长,RNA-pol大亚基CTD被TFH磷酸化才能离开起动子区域并进入延长阶段。,与原核生物不同的是，没有转录与翻译同步的现象；但转录延长过程中随RNA pol前移，可以观察到核小体移位或解聚现象。,真核生物的转录延长过程与原核生物相似，RNA聚合酶沿DNA模板链35方向移动，并按模板DNA链碱基序列催化RNA链的延长。,下午3时31分,42,图13-12 真核生物转录延长中的核小体移位,下午3时31分,43,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶、解旋酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,（三）转录终止,-真核生物mRNA转录终止及加尾修饰。,下午3时31分,44,剪切信号序列,真核生物RNA前体的加工,第四节,Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA,学习要求：,掌握真核基因的断裂基因、内含子、外显子和剪接体概念，mRNA 的首、尾修饰，tRNA 和 rRNA 转录后加工修饰特点；熟悉内含子剪接机制，核酶锤头结构的作用特点和研究意义。了解内含子的分类和mRNA编辑，tRNA和rRNA转录后加工过程，基因概念的定义与延伸；siRNA、microRNA和长链非编码RNA（lncRNA）的定义及应用。,下午3时31分,45,真核生物中几乎所有的初级转录产物(primary transcript)，都需经一定程度的加工(processing)才具有生物学功能。,原核生物转录的mRNA不需加工即能作为翻译的模板，但rRNA和tRNA初级转录产物也需加工成熟。,下午3时31分,46,核苷酸的部分水解、剪接，链末端的“加帽”和“加尾”，核苷酸的修饰等。,一、mRNA前体的加工,真核生物成熟mRNA的前体hnRNA，需在细胞核内进行加工修饰，才成为具有生物学功能的成熟mRNA。,mRNA前体的加工修饰包括：,切除内含子和连接外显子的剪接；,5端加帽和3端加尾的首尾修饰；,核苷酸的甲基化等。,下午3时31分,47,（一）hnRNA,断裂基因(split gene)*：真核生物结构基因由若干个编码区和非编码区相间镶嵌连接而成。,真核基因中的编码序列称为外显子(exon)，非编码序列称为内含子(intron)；在内含子和外显子的交界处/分支点有两个相当短的保守序列，5端为GT/GU，3端为 AG，此称为GT/GU-AG规则。,*Roberts和Sharp20世纪70年代提出，获1993诺贝尔生理/医学奖。,下午3时31分,48,是指核内未被剪接、含有内含子的mRNA前体，称为不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA)或杂化核RNA(hetero-nuclear RNA)。,核酸分子杂交研究鸡卵清蛋白断裂基因及其初级转录产物的加工,卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,剪接过程中套索RNA的形成,mRNA 形成,脊椎动物编码蛋白质的基因只有为数不多的基因 没有内含子，如组蛋白基因。,某些低等真核生物编码蛋白质的基因也缺乏内含 子，如酿酒酵母的许多基因。,有些原核生物的基因也有内含子，如一些真细菌(eubacteria)和古细菌(archaebacteria)的基因。,.真核生物基因中存在内含子的普遍性,抗肌萎缩蛋白(distrophin)基因是人类最庞大的 基因，全长数百万(106)bp，含50多个外显子和 50多个内含子；成熟的mRNA仅有约1万bp。,下午3时31分,50,：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核 生物的rRNA、mRNA和tRNA基因中；,.据基因类型和剪接方式,内含子分为4类：,：存在于线粒体、叶绿体的mRNA基因中；,：常见于大多数mRNA基因，常形成套索结构后剪接；,：存在于tRNA基因,剪接过程需酶及ATP。,已发现类和类内含子中有相当一部分具有自身剪接（self splicing）作用；,下午3时31分,51,.一些内含子也具有多种生物学功能：,具有可移动和转座功能，很可能参与RNA介导的 细胞调节功能；,可调节 mRNA的选择性剪接，还可产生有功能活性 的RNA；,可形成发夹状miRNA，利用RNAi机制调节其它基因 的表达；,某些遗传性疾病的基因变异发生在内含子。,下午3时31分,52,非编码RNA：不被翻译成蛋白质的功能性RNA的统称。,下午3时31分,54,基因(gene)概念的延伸：,是指在染色体上占有一定位置的遗传基本单位，含有一种多肽或RNA的编码信息。,是分布在染色体上的遗传基本单位，是负载着特定遗传信息的DNA片段，由多肽或RNA编码序列、内含子序列和调节序列组成，可编码一个或多个具有生物学功能的多肽或RNA。,是分布在染色体上的遗传基本单位，是负载有特定遗传信息的DNA片段，由多肽编码序列、内含子序列和调节序列组成。,（二）mRNA剪接,是指去除初级转录产物hnRNA的内含子，把外显子连接为成熟mRNA的过程。,剪接体(splicesome),*小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)富含U，简称U，有U1、U2、U4、U5和U6等类别。,真核生物hnRNA剪接的场所,真核生物mRNA剪接的基本过程：,1小核核蛋白体(snRNP)中的U1和U2 snRNA与内含子 边界序列(5端为GU，3端为 AG)结合；,2U4、U6和U5 snRNA加入，形成完整但无活性剪接 体，内含子形成套索；,3调整结构，构建活性中心，形成活性剪接体；,4催化二次转酯反应，完成切除内含子和连接外显 子的剪接过程。,下午3时31分,56,图13-17 剪接体的装配和剪接过程,1snRNA 与内含子边界序列结合；2形成完整但无活性剪接体，内含子形成套索；3形成活性剪接体；4完成剪接过程,下午3时31分,57,图13-18 剪接过程的两次转酯反应机制,下午3时31分,58,（三）mRNA编辑,指在mRNA水平上，通过核苷酸的缺失，插入或替换而改变遗传信息的过程。,通过mRNA编辑，可使一个基因产生多种氨基酸序列不同、功能不同的蛋白质，结果不仅扩大了遗传信息，而且使生物能更好地适应生存环境。,下午3时31分,59,如人类基因组上只有一个载脂蛋白B（apoB）基因，转录后加工成熟的mRNA 含14,500个核苷酸。在肝脏细胞内该mRNA表达513kD的apo B100；在小肠黏膜细胞内则表达250kD的apo B48。,图13-19 载脂蛋白B mRNA的编辑加工,下午3时31分,60,（四）mRNA首、尾的修饰,绝大部分真核细胞成熟mRNA的5端都有一个7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷(m7G-5ppp5-N-3)起始的“帽子”结构，3端有一段长约80250个核苷酸的多聚腺苷酸(polyA)尾。,hnRNA的“加帽”是在转录生成的hnRNA长度为2530个核苷酸时形成的。,hnRNA poly A尾的添加是在转录终止时进行的；先由核酸内切酶在AAUAAA信号下游1030个核苷酸处切断，再由多聚腺苷酸聚合酶(poly A polymerase)催化逐个加入腺苷酸。,下午3时31分,61,mRNA的“帽子”结构有3种类型：,0型帽：5-m7GpppN-,型帽：5-m7GpppmN-；M7和第一位核苷酸的2-OH也甲基化。,型帽：5-m7GpppNmNm-；M7和第一、第二位核苷酸的2-OH均甲基化。,mRNA的“帽子”的结构和分类,下午3时31分,62,图13-20 mRNA5端“0型帽”结构的形成（右）及其5，5-三磷酸双鸟苷结构（左）,H,H,下午3时31分,63,5端“帽子”与帽结合蛋白(CBP)结合，可增加 mRNA的稳定性，并对mRNA从细胞核向细胞质的转 运有重要作用。,poly A是维持mRNA稳定性和翻译模板活性的重要 因素。,poly A与poly A结合蛋白(PABP)相结合的形式存 在，可与5端“帽子”协调mRNA从核内向胞质的 转位、维系mRNA的稳定、调控翻译的起始。,5端“帽子”为核糖体对mRNA识别的信号，协助 核糖体和翻译起始因子与mRNA结合。,5端“帽子”结构和3端poly A尾的功能,下午3时31分,64,二、tRNA前体的加工,酵母tRNAtyr前体的加工,RNase P切除5端16个核苷酸的前导序列；,RNase D切除3端的两个UU，由tRNA核苷酸转移酶催化添加CCA-OH；,稀有碱基的形成,嘌呤甲基化：AmA，Gm G；DHU环上的U被还原为DHU；T 环上的U转变为；反密码上的A脱氨转变I。,下午3时31分,65,通过剪接反应切除中部14个核苷酸的插入序列；,tRNA的初级产物,成熟 tRNA,剪接反应,转移酶,下午3时31分,66,RNase P,Rnase D,碱基修饰,下午3时31分,67,三、rRNA的转录后加工,真核生物18S、28S 和5.8S rRNA 基因(rDNA)处于一个转录单位上，前体是编码约含14,000个核苷酸的45S rRNA。,45S rRNA经剪切，先产生18S rRNA，余下的部分再剪切产生5.8S 和28S rRNA；,下午3时31分,68,18S、28S 和5.8S rRNA的成熟过程还包括核苷酸的甲基化修饰。,剪切和甲基化反应均需小核仁RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)参与。,图13-23 rRNA前体的加工过程,下午3时31分,69,核酶(Ribozyme)的概述：,核酶是一种具有核酸内切酶活性的反义RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力。,脱氧核酶,核酸酶,下午3时31分,71,核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶mRNA分子切断。,（1）证明了RNA具有催化功能，丰富了酶的概念（2）为RNA生命起源学说提供了证据（3）具有极好的应用前景:是研究RNA结构的有力工具 在mRNA水平上阻断有害基因表达 抗病毒感染 抗肿瘤等,发现ribozyme的意义：,原核生物和真核生物转录的比较,