J12,13实训三 菠萝蛋白酶的制备及活力测定.doc

第十二、三讲授课内容实训五菠萝蛋白酶的制备及活力测定授课时数4教学目标1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、菠萝蛋白酶活测定方法教学重点菠萝蛋白酶提取方法原理和酶活保护措施教学难点单宁沉淀蛋白的酶活保持教材教具教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等）实训五菠萝蛋白酶的制备及活力测定一、目的和要求1、掌握菠萝蛋白酶制备的基本原理和方法；2、掌握菠萝蛋白酶活测定方法。二、原理菠萝蛋白酶具有一定的医疗保健功能：1、抑制肿瘤细胞的生长；2、对心血管疾病的防治；3、用于烧伤脱痂；4、消炎作用；5、增进药物吸收。单宁又称鞣酸、丹宁酸，是多酚中高度聚合的化合物，它们能与蛋白质（酶）形成难溶于水的复合物，是蛋白沉淀剂。本试验即利用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶。EDTA、Vc和L半胱氨酸具有保护酶活功能；锌离子、硫代硫酸钠等具有酶活激活的作用。活性测定方法是以酪蛋白水解释放的酪氨酸在275nm的吸收值为基础，酶活单位定义为：在测定条件（37±0.2；pH值7.0）每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长有吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g表示。三、实验材料1、材料菠萝（7090%成熟度，榨汁）2、器材100ml量筒、500ml烧杯（2个）、100ml烧杯、玻璃棒、漏斗、纱布、干燥器、离心机、紫外分光光度计。3、试剂苯甲酸钠、单宁、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、NaCl、乙酸锌、抗坏血酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、Na2HPO4、NaH2PO4、酪蛋白。四、实验步骤1、提取（1）取一定量的菠萝皮汁（约 ml），加5%苯甲酸钠10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，取上清液倒入另一烧杯中；（2）缓慢加入0.2%单宁溶液75ml，边加边搅拌约15min，沉淀物析出，静置40min；（3）虹吸除去上清液，沉淀物以4000rpm离心5min，倾去上清液，得酶糊状物。2、洗涤与保护（1）酶糊倒入烧杯，加0.1%EDTA溶液100ml，搅匀，再加1.5%NaCl溶液200ml搅匀，4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物I；（2）将酶复合物I倒入烧杯，加0.5%乙酸锌溶液20ml，搅匀，静置5min；加0.06%Vc溶液30ml，搅匀，静置5min；再加1.5%NaCl溶液20ml，搅匀静置5min；最后加0.5%EDTA溶液20ml，搅匀静置5min；以4000rpm离心7min，倾去上清液，得酶复合物II；（3）将酶复合物II倒入烧杯，加0.5%硫代硫酸钠溶液20ml，搅匀静置5min；加1% L-Cys溶液10ml，搅匀，以4000rpm离心7min，倾去上清液，得菠萝蛋白酶糊。 3、冷冻干燥将所得酶糊放入冰室（12），冷冻1520h，取出解冻，离心得酶膏；将其放入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥610h，得干酶，研磨成粉状，低温保存。 4、酶活测定（1）酶液制备取所得酶制剂0.15g，加入0.05mol/L（pH7.0）PBS定容至100ml，过滤。滤液即为工作酶液。（2）活性测定取3只试管，按下表加入试剂，及其他操作。（各试剂于37水浴保温至恒定）试剂管号123酶液（ml）1%酪蛋白溶液（ml）101111混匀，37保温10min1mol/L NaOH（ml）1%酪蛋白溶液（ml）818080迅速摇匀，室温下静置30min取上清液于275nm波长下测定吸光值五、结果与讨论1、计算菠萝蛋白酶得率（g/100g），并计算所得酶制剂的活性（U/g）。2、讨论影响菠萝蛋白酶得率及活性的主要因素。课后体会：