热处理对大豆乳清蛋白之间形成可溶和不可溶蛋白复合物的相互影响.doc

热处理对大豆/乳清蛋白之间形成可溶和不可溶蛋白复合物的相互影响（2005，IF:2.562，RODRIGO R. ROESCH AND MILENA CORREDIG*）摘要：利用流变学、镜检、凝胶过滤层析、电泳技术研究含有乳清蛋白和大豆蛋白的混合溶液经加热处理时的聚合反应。总蛋白浓度为6%的大豆/乳清蛋白复合物形成的凝胶具有很高的弹性模量、表面没有明显分离状态，。大豆和乳清蛋白的比例是形成聚合物类型的基础。含有高大豆和乳清蛋白比例（大豆蛋白>70%）的体系在热处理过程中随着两种蛋白表面网状结构发生变化，弹性模量也发生不同的变化。乳清和大豆蛋白在加热过程中形成二硫键；在低大豆和乳清蛋白的比例情况下，7S、11S、-乳球蛋白似乎在聚合过程中起着决定性的作用。凝胶过滤层析表明在含有高大豆和乳清蛋白比例的混合物中，有高分子量可溶性复合物存在。此结果为分离和乳清蛋白之间的相互作用提供了依据，并且表明有形成新功能性物质的可能。关键词：大豆蛋白 乳清蛋白 聚合0绪论19世纪70年代，随着对传统动物蛋白需求量的增高，人们越来越对大豆蛋白在食品中的应用感兴趣。大豆分离蛋白被添加到酸奶中代替脱脂奶粉、稳定剂、酪蛋白钠。还被用在咖啡奶精、婴儿奶粉中部分或全部的代替乳清蛋白。但是又具有挑战性，尤其是其较低的功能特性和豆腥味限制其在新型饮料中应用。目前，又有很多的人对大豆蛋白的功能特性感兴趣，一方面是因为越来越多的大豆蛋白因子可以被利用，也许更重要的是因为越来越多的消费者对含有大豆蛋白的产品感兴趣。此需求至少一部分引起了人们对消费含有足够量大豆蛋白产品的健康要求。混合大豆蛋白体系中蛋白质的相互作用的研究是有限。总的来所，研究主要集中在大豆蛋白和乳清蛋白在产品中功能作用。比如：大豆蛋白和乳清蛋白添加到酸奶后所制的产品进行了比较。很少有研究是关于大豆蛋白和乳清蛋白所形成的复合物在食品加工中的特性报道。一个研究是关于乳清凝乳酶中含有大豆蛋白，结果表明：大豆蛋白可以吸收酪蛋白颗粒或者是可以陷入到酪蛋白颗粒所形成的网状结构中。干扰它的卷曲结构并且引起他的凝胶力度的降低。在大豆蛋白和乳清蛋白混合体系中，经加热过程可以形成多种类型的复合物；但复合物的形成机理不太清楚。目前，文献中不同意见主要集中在原料和加工工艺的不同。Chronakis和kasapis（4）运用市场上的大豆蛋白（蛋白含量90%）研究乳清/大豆蛋白凝胶的流变学性质。由于加工工艺的原因，此大豆蛋白有较大的分子量片段和较低的溶解度。在这个体系中观察了蛋白的相变；凝胶的结构依赖于蛋白质的比例。高大豆蛋白比例（>11%）混合物形成了连续的网状结构，而低大豆蛋白比例混合物，乳清蛋白形成的网状结构内含大豆蛋白。Comfort和howell（5）研究了某浓度下加热过程是产生的相变和大豆蛋白质中各种蛋白质的比例。相变可能是因为加工过程而引起的。有趣的发现是少量的分离蛋白加入到乳清蛋白中引起凝胶强度的增加。虽然在加热过程中混合的大豆/乳清蛋白混合有相变发生，但是添加了葡萄糖酸-内酯的蛋白混合物，所形成的凝胶没有相变发生(6)。乳清蛋白中加入大豆蛋白能改变酸性凝胶的微观结构：所形成的凝胶结构与单个乳清蛋白所形成的结构相比，更少有分支而多有颗粒状。除此之外，当少量的乳清蛋白被大豆蛋白顶替时，凝胶的强度和pH值都有增加（6）。含有乳清蛋白的大豆蛋白在加热过程中形成大块状的聚合物（6）。此聚合物是通过二硫键或其他的非共价键在大豆蛋白、乳清蛋白和一些酪蛋白之间形成。在酸化过程中，这些聚合物在蛋白质的网状结构中聚合为一体。大豆蛋白和乳清蛋白之间所形成的复合物能够优化蛋白食品的结构和增加其稳定性。而聚合物形成机理和他们直接的相互作用类型需要进一步研究。内含大豆蛋白的乳清蛋白所形成的复合物能为许多新型的功能因子的设计提供方便。本文主要研究大豆/乳清蛋白混合体系的聚合反应和可溶和不可溶蛋白复合物是如何形成的。1材料与方法1.1蛋白样品的制备大豆蛋白来源于solae公司，因为有轻微的加工影响，蛋白质需要精选。蛋白悬浮液4过夜使其完全水解，然后再在4下透析（截留分子量6000-8000）24h使其进一步纯化。透析完成后，进行冷冻干燥。所制的蛋白质浓度为84%（w/w）。乳清分离蛋白来源于land公司，不需要进一步的纯化。冷冻干燥大豆蛋白制品和乳清蛋白的混合溶液至少得搅拌2h，然后再用1M NaOH调到pH7.0,4过夜使蛋白质充分的水解。然后样品被放置在室温下，8000g、23条件下离心20min。收集上清液，测定蛋白质浓度。1.2流变性质分析混合蛋白溶液的浓度为6%，溶液所含大豆蛋白和乳清蛋白的比例分离为100：0、90：10、70：30、50：50、30：70、10：90和0：100.在加热过程中检测其弹性性的变化状况，利用可控应力流变仪测定不同时间、不同温度条件下的储能模量变化（G）和损耗模量的变化（G）。为了防止样品的蒸发，一小层矿物油（约0.5mL）被涂在样品表面上。为了诱导凝胶的形成，混合物不断加热，温度每分钟升高1（升温速度1/min），从30升高到90，90保持1h，再每分钟下降1，从90降到30。在最终温度下，通过连续10Pa倍的变化来改变频率变化范围（包含样品的线性弹性性变化范围）。通过测定不同G和G值的频率相关性评价不同大豆/乳清蛋白比例下的不同机械特性。logG（logG）的斜率与logw（w=频率）一一对应，其表示频率相关性。其值在不同的大豆蛋白混合物中有不同的计算值。1.3数据分析：测定结果平行三次，用SAS软件分析数据。1.4镜检用先前roesch描述的方法制的样品。简单的说，少量的样品转移到带小洞的物镜上，样品用盖玻片盖上，上面滴点油密封。物镜用塑料包裹上，用90的热水冲洗10min到1h。热处理后的凝胶用好带有三层滤过片（波长为488/543/633nm）的显微镜镜检，样品再用100X/1，40-0.7HCX油镜观察。1.5凝胶过滤层析测定可溶性聚合物：3%的氢化后的冷冻干燥的大豆蛋白或者是乳清蛋白在pH 7.0的0.05M Tris-0.1M Nacl溶液中搅拌2h。大豆蛋白液需要用均质机均质处理。蛋白样品在4放置过夜为了使蛋白完全氢化。经8000g 23离心20分钟后，上清液用0.45um滤膜过滤，测定其蛋白浓度。大豆和乳清蛋白按30：70和70：30的比例制的蛋白浓度为1.4%的溶液。经过混合后，样品加热到90（每分钟升高4）。通过用缓冲液稀释大豆或者乳清蛋白来制的控制样，获得初始浓度为70%或30%。加热还是按照上面描述的方法进行。混合蛋白和控制样用二硫键阻滞剂N-苯基马来酰胺处理。然后再经90处理30min。混合蛋白中NEM的添加量按照硫醇基德含量计算。用带有2个连续柱的高效液相色谱进行凝胶过滤层析。一个柱的分离范围为4×104到2×107葡聚糖标准品，另一个柱分离范围为2×103到4×105葡聚糖标准品。流速1mL/min，温度室温。上清液、过滤液用pH7.0的0.05M Tris和0.1M NaCl缓冲液稀释，每次注入1mL。总峰被收集、透析、冷冻干燥。用SDS-PAGE电泳分析离心后的沉淀和上清液中的组成由什么不同。离心后的沉淀用缓冲液(0.05M Tris和0.1M NaCl, pH7.0)进行冲洗，在8000g离心3min。再用300uL的缓冲液（0.020M Tris和0.002M EDTA pH8.0）溶解12mg再与样品缓冲液混合。125uL的液体样品用200uL的pH8.0的Tris-EDTA缓冲液进行稀释，然后再与样品缓冲液混合。样品在95时加热5min。经上述过程后制备的溶液用SDS-PAGE电泳进行分析。2结果讨论2.1凝胶混合物，流变性质和镜检图1不同蛋白比例的混合物不同时间的弹性模量的变化趋势图通过可控应力流变仪测定在加热时不同大豆和乳清蛋白的比例对凝胶效果的影响。表1描述了不同比例下的弹性模量的变化情况。总之，两者的比例变化影响着混合物中的凝胶反应。蛋白含量为6%的样品加热处理后形成凝胶，但是乳清蛋白在所中形成的网状结构发挥的主要主用。没有观察高比例（100：0和90：10）蛋白下形成的凝胶，是因为大豆蛋白质含量高肯定能形成清楚的凝胶。蛋白浓度为12%经常被报道（5，7）。乳清蛋白含量大于30%的样品和70：30比例的样品表现出不同的聚合反应。乳清蛋白含量大于30%的样品在温度高于70时加热55min后弹性模量都升高。70：30比例的样品弹性模量从81升高到89有所增高，似乎最终又达到了一个新的水平。低乳清蛋白浓度比高乳清蛋白浓度的样品90加热一段时间（70-80min）后，弹性模量下降。与其他蛋白混合样品比较，70：30的比例的样品在冷却时弹性模量又进行第二阶段的增长。此表明氢键在大豆蛋白形成的网状结构中起着主要的作用。乳清蛋白浓度>50%的样品与乳清蛋白浓度为0%的样品所形成的凝胶反应没有什么不同，此现象表明乳清蛋白在所形成的网状结构中起着部分作用。表1：浓度为6%的蛋白浓缩物不同大豆/乳清蛋白比例下的G和G的频率相关性冷却完成后立刻测定其频率变化范围。乳清蛋白含量大于50%的样品几乎没有频率相关性。乳清蛋白含量大于50%样品中G和G”的斜率没有显著差异。换句话说，蛋白比例为70：30样品的G和G”的斜率有明显的不同和显著的频率相关性。总蛋白浓度为6%的样品当大豆蛋白占有很高的比例削弱了网状结构。所有样品除了70：30蛋白比例的混合物的粘弹模量明显不同以外，其他的都大致一样，此表明他们具有类似的机械性能和凝胶强度。与先前的大豆/乳清蛋白混合物（5）相比，这些样品中没有发生明显的相变的分离和相变的转化。这些蛋白混合物中缺少大量的聚合物质是此结果与以前结果不同的主要原因。所有的样品在混合前都需要离心和过滤，来消除蛋白原料中大颗粒的聚合物质。尽管本文研究的是低浓度（6%），但是与前面的参考文献（4，5）相比较蛋白溶液的G值类似。镜检表明不同的大豆/乳清蛋白比例影响着蛋白质的微观网状结构。与参考文献（8）的观点一样，仅含有乳清蛋白的样品表面粗糙但结构均匀（2A）。混合样中少量大豆蛋白的加入（大豆/乳清蛋白比为30：70）改变了均匀的网状结构，形成了大颗粒状的聚合物。在此条件下，大豆蛋白和乳清蛋白可以形成凝胶。在往混合物中加入大豆蛋白，当蛋白比例为50：50时，降低了蛋白子颗粒的体积（2B-D）。2E描述了蛋白比例为70：30时，不连续的网状结构。此网状结构显示了较大的孔径，这可以表明有液固分离。不同蛋白比例（70：30，50：50，30：70）下的流变特性的不同与其微观结构的不同紧密相连。高大豆蛋白比例的混合物经过加热处理，测定出它有2个聚合阶段，第一个阶段是是89，第二个阶段是冷却时。此两个阶段表示先是在加热过程中乳清蛋白然后是大豆和乳清蛋白直接发生聚合反应。此结果通过样品在90加热60min和90加热10min现象相同得以论证。 图2：蛋白浓度为6%的样品经90处理1h形成的凝胶不同蛋白比例下的电镜扫描图不同蛋白比例的图像：0/100(A),10/90 (B),30/70 (C),50/50 (D),and 70/30(E);bar 20um.2.2色谱和电泳分析虽然流变学和镜检表明样品经加热处理在大豆和乳清蛋白之间形成复合物以及不同的蛋白比例决定着聚合物的类型。但是凝胶过滤层析和电泳能够更好的检测分子间相互影响情况。低浓度的蛋白溶液（1.4%）经过加热处理；选择2种蛋白比例70：30和30：70.大豆和乳清蛋白控制样分别配置成70%或30%。分别进行分析检测。 图3：蛋白比例为70：30的混合物离心后的上清液蛋白洗脱曲线（实粗线）；总蛋白浓度为30%乳清蛋白控制样（实细线）；总蛋白浓度为70%大豆蛋白控制样（点线）。A图未经加热处理；B图90加热10min;C图90加热60min。图3显示蛋白比例为70：30的样品经离心后所得上清液的色谱分离状况。热处理前蛋白混合物中可溶性片段与2个控制样具有相同洗脱峰，这两种蛋白控制样具有相同的大豆或者乳清蛋白浓度。经过热处理，两个控制样的洗脱峰在减少，而混合物在100min时有明显的洗脱峰。这些结果表明当有高比例的大豆蛋白存在时，热处理能形成可溶性复合物。热处理10min比热处理60min后具有更高的洗脱峰，加热处理60min后许多蛋白质变成固态。经过热处理后，原来的乳清蛋白都变成不可溶。大豆和乳清蛋白混合物经过热处理形成的可溶性复合物不仅与温度、时间紧密相连而且还与混合样中乳清蛋白的利用情况相关。图4 图5图4：蛋白比例为70：30的混合样90处理10min，凝胶过滤层析收集的洗脱峰的凝胶电泳图（带1：还原状态；带2：非还原状态（未加巯基乙醇）图5. 蛋白比例为70：30的混合样90处理10min，离心所得上清液和沉淀还原状态下的凝胶电泳图。（带1：混合样（70：30）上清液；带2大豆蛋白控制样上清液；带3乳清蛋白控制样上清液；带4混合样（70：30）沉淀；带5大豆蛋白控制样沉淀；带6：乳清蛋白控制样沉淀）10min条件下的洗脱峰收集的样品进行电泳分析，图4表明大豆蛋白和乳清蛋白都存在于可溶性聚合物中.蛋白复合物主要通过二硫键形成，从电泳的第二条带可以看出，非还原状态下，仅有少量的7S亚基存留在凝胶体系中。蛋白比例为70：30的混合物经热处理离心后所得的上清液和沉淀经电泳分析表明所有的大豆蛋白亚基和-乳白蛋白和-乳球蛋白都存在于所形成的混合物的上清液和沉淀中（图5）。加热到60min时混合溶液的可溶性部分含有所有的大豆蛋白亚基和-乳白蛋白和-乳球蛋白。这与图4所反映的可溶性吸收峰的组分相同。乳清蛋白似乎平等的分布在蛋白比例为70：30混合物的上清液和沉淀中。当大豆蛋白被单独加热，只有少量的大豆蛋白存在于沉淀中（带5，图5）。单一的大豆蛋白和乳清蛋白样品经加热处理后，蛋白在上清液和沉淀中的分布有所不同。这些表明经加热处理，-乳白蛋白、-乳球蛋白和蛋白质的一些亚基之间存在二硫键。但是这也不排除可溶性聚合物仅仅有乳清蛋白构成。 图6：有NEM存在的样品90处理10mim后上清液的蛋白洗脱曲线（70%大豆蛋白控制样，点线；30%乳清蛋白控制样，细实线；蛋白比例70：30混合样，粗实线）为了测定二硫键在大豆/乳清蛋白的混合物中的作用，70：30蛋白混合样品中在加热处理时添加了NEM（二硫键抑制剂）。NEM也被添加到大豆蛋白和乳清蛋白控制样中。当有NEM 存在，样品经90处理10min后的色谱图见图6.当与没有MEN存在的样品经同样条件下处理后见图3B的色谱峰进行比较.明显的看到NEM抑制了大量可溶性复合物的形成。NEM之说以抑制了乳清蛋白可溶性聚合物的形成，是因为原来的乳清蛋白经过热处理仍然为液态，没有发生变化。当NEM影响着乳清蛋白聚合物的形成时，有NEM 存在的单一的大豆蛋白经过热处理后所显示出来的洗脱峰没有发生变化，这些现象表明非共价键的相互作用在大豆蛋白聚合物中起着重要的作用。 图7. 蛋白比例为70：30的混合样90处理10min，离心所得上清液和沉淀的凝胶电泳图。还原状态（A）非还原状态（B）。带1：混合样上清液；带2：大豆蛋白控制样上清液；带3：乳清蛋白控制样上清液；带4：添加NEM的混合样上清液；带5：添加NEM的大豆蛋白控制样上清液；带6：添加NEM的乳清蛋白控制样上清液；带7：混合样沉淀；带8：添加NEM的混合样沉淀；带9：乳清蛋白控制样沉淀；带10：添加NEM的乳清蛋白控制样沉淀。注：大豆蛋白控制样的沉淀因没有含有足够量的蛋白而不进行分析。图7描绘了70：30蛋白比例的混合物经当有NEM存在与否，经热处理后的可溶性和不可溶性复合物的电泳变化图。有NEM存在的单一的大豆蛋白控制样经热处理后不影响可溶性部分的电泳图（带2和带5）。换句话说，当有NEM存在的乳清蛋白控制样经热处理后，其可溶性部分存有较多量原来的乳清蛋白（带3和带6）。不可溶片段分析表明-乳白蛋白和-乳球蛋白主要是通过二硫键形成复合物。当有NEM存在经过热处理，仅有-乳球蛋白存在于乳清蛋白控制样中。70：30大豆/乳清蛋白混合物经热处理时NEM影响着大多数可溶性大豆蛋白的存在（带1和4）。这些结果似乎表明70：30的大豆/乳清蛋白样品是通过二硫键形成可溶性复合物的。这些可溶性复合物含有乳清蛋白，但也有可能一些大豆蛋白也参与形成了可溶性复合物。70：30比例的蛋白混合物的沉淀当有NEM存在与否，经热处理后结果有所不同（带7和带8）。与热处理后乳清蛋白控制样所显示的结果一样，仅当二硫键存在时，-乳白蛋白存在于沉淀中。并且，当有NEM存在经热处理时，大豆蛋白的酸性和基本片段11S似乎有少量存在于沉淀中。当不可溶部分在非还原状态下进行分析，虽然二硫键是形成含有-乳白蛋白和11S片段蛋白的必须条件，但一些7S和-乳球蛋白转移到凝胶中，证明非共价键的相互影响在复合物的形成中也起着重要的作用。 图8：蛋白比例为30：70的混合物离心后的上清液蛋白洗脱曲线（实粗线）；总蛋白浓度为30%乳清蛋白控制样（实细线）；总蛋白浓度为70%大豆蛋白控制样（点线）。A图未经加热处理；B图90加热10min;C图90加热60min。 图8描述了30：70蛋白比例的混合样品与乳清蛋白和大豆蛋白控制样的色谱比较图。乳清蛋白在180min时出现了与-乳白蛋白和-乳球蛋白相对应的两个不分开的洗脱峰。未经热处理的大豆/乳清蛋白混合样与大豆蛋白和乳清蛋白控制样的色谱图进行比较，结果与70：30蛋白比例混合物类似，混合后的蛋白样品未经加热没有产生聚合物。当单一的乳清蛋白进过热处理，离心后产生大量沉淀。上清液中仅有少量-乳白蛋白，随着加热时间的延长，越来越多的-乳球蛋白存在于沉淀中。单一的大豆蛋白进过热处理后形成大量可溶性聚合物，离心后也没产生沉淀。在10min出现的洗脱峰在70：30蛋白比例的混合样已经讨论过（图3）。30：70蛋白比例的混合样的可溶性部分经热处理后显示出不同的洗脱峰。当单一的大豆蛋白形成大量可溶性聚合物时，添加了乳清蛋白明显的降低了可溶性蛋白的含量，产生沉淀。随着加热时间的延长，单一大豆蛋白所显示的洗脱峰在混合样中没有出现，原来的乳清蛋白洗脱峰（主要是-乳白蛋白）的体积也逐渐降低。加热10min后，与30：70的蛋白比例混合样不同，只存在很少量的可溶性聚合物。加热时间越长，乳清蛋白形成可溶性复合物越少，许多蛋白洗脱峰都变成了空体积。可以得出结论，在此条件下，大豆蛋白和乳清蛋白不能聚合成共价聚合物。图9：蛋白比例为30：70的混合样90°C加热10min后离心所得上清液和沉淀的电泳图。带1：混合样上清液；带2大豆蛋白控制样上清液；带3乳清蛋白控制样上清液；带4混合样沉淀；带5大豆蛋白控制样沉淀；带6：乳清蛋白控制样沉淀图9描述了30：70蛋白比例混合物的可溶和不可溶部分的蛋白电泳图。经加热处理后的沉淀，大多数11S和7S亚基存在于乳清蛋白中。换句话说，单一的大豆蛋白经加热处理，所有的蛋白组分仍然是可溶的。当乳清蛋白中有大豆蛋白存在时进行加热，与乳清蛋白控制样进行比较，更多的-乳白蛋白似乎存在于沉淀中。这些结果证明大豆蛋白亚基和-乳白蛋白、-乳球蛋白之间存在共价影响。在加热过程中，大豆和乳清蛋白的比例是形成聚合物类型的基础。可以这么假设当乳清蛋白浓度足够大时以至于能形成聚合物和网状结构，大豆蛋白被添加到聚合物中；而乳清蛋白很少量时，各种类型的可溶性复合物可以形成，一些仅含有乳清蛋白，而另一些是大豆蛋白和乳清蛋白的混合物。