化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解.doc

化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定 UDC 668：576 .85.07(GB7918.287)Standard methods of microbiological examination for cosmetics Standard plate count细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌，数量。测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。本标准采用标准平板计数法。1 方法提要化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理物质性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37培养48h)生长的一群嗜中温的需氯及兼性厌氧的细菌总数。2 培养基和试剂2.1 生理盐水：见GB 7918-87化妆品微生物标准检验方法 总则。2.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基成分： 蛋白胨                20g牛肉膏                             3g氯化钠                            5g琼脂                             15g卵磷脂                           1g吐温80                           7g蒸馏水                    1000ml制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.17.2，加入琼脂，121(15 1b)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。3 仪器3.1 锥形烧瓶。3.2 量筒。3.3 pH计或精密pH试纸。3.4 高压消毒锅。3.5 试管。3.6 灭菌平皿：直径9cm。3.7 灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。3.8 酒精灯。3.9 恒温培养箱。3.10 放大镜。4 操作步骤4.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平甲内，每皿1ml。另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，使成1:100稀释液。吸取2ml,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，······等，每种稀释度应换1支吸管。4.2 将熔化并冷至4550的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待不琼脂凝固后，翻转平皿，置37培养箱内培养48h。5 菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大510倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。6 菌落计数及报告方法6.1 首先选取平均菌落数在30300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例）。6.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数(见表中例2及例3)。6.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。6.4 若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5)。6.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6)。6.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。6.7 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见下表报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。细菌计数结果及报告方法例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数个/g或个/ml报告方式个/g或个/ml10110-210311365164201640016000或1.6×10422760296461.63800038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044不可计4650513-523000510000或5.1×105527115-270270或2.7×1026不可计30512-3050031000或3.1×104 附加说明：本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释注解:（1）操作注意事项1）尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。2）制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。3）注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。4) 对照试验。化妆品的稀释液（特别是1:1O的稀释液）常带有化妆品颗粒，有时与菌落很难区分，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4环境中，以便计数检样菌落时用作对照。另一种防止化妆品颗粒与菌落混淆的方法是培养基中加TTC（2）细菌总数其他测定法1) 改良的细菌总数测定法一TTC法化妆品一般由多种物质混合而成，在进行细菌测定前虽然经过处理，但有时还会存在极难溶解的颗粒,特别是粉类化妆品和某些膏霜类化妆品。化妆品在前处理时有气泡产生，颗粒和气泡容易与细菌菌落相混，影响计数的准确性。方法：在已熔化的卵磷脂吐-80营养琼脂中，按100ml加入1m1 0.5的氯化三苯四氮唑（2,3,5 triphenyi terazoloride ，TTC）水溶液之量加入，操作方法同标准法。培养后如系化妆品的颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。配好的含TTC培养基，应先用未加TTC的对照，以观察其计数是否有不利影响（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。TTC溶液在使用前应在水浴中煮沸半小时。原理：无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日组成的字，因无此字）（fomazan），使菌落呈现红色，其反应式见结构图：2）平板表面涂布法将培养基制成平板，经干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2ml，用“L形玻璃棒涂布于整个平板的表面，放置片刻（约10分钟）将平板翻转，放入37温箱内培养48小时，取出进行菌落计数，然后乘以5，即为1ml稀释样中的菌落数，再乘以稀释倍数，即得每克（或每毫升）检样所含菌落数。此法的优点：菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，与检样中的颗粒易区别；细菌不必遭受融化琼脂的热力，不致因此而使细菌细胞受到损伤而不生长。此法缺点：取样量较倾注法少，代表性将受到一定的影响；本来只有0.2ml的量又被 “L”棒蘸去部分，使菌落数受影响。（3）菌落计数及报告注意事项1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的菌落数，除以2求出lcm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘以其稀释倍数。以此结果作报告，例如：10-110-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每克（或ml）中“估计”菌落数为：60÷2×63.6×10001.9×10663.6是按皿底直径为9cm时计算而得的面积，如所用乎皿底直径不是9cm，应另求面积。4）鉴于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌落数应以单位重量（g）或容量（ml）的菌落形成单位（Colony formingunits CFU）报告更恰当。