高效液相色谱蒸发光检测器法》 .doc

烟草及烟草制品 麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的测定 高效液相色谱蒸发光检测器法标准项目试验报告烟草及烟草制品 麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的测定 高效液相色谱蒸发光检测器法标准项目组2012年3月目 录1. 综述12. 实验原理22.1 实验原理22.2 蒸发光检测器工作原理723. 材料与研究方法33.1 仪器及试剂33.2 研究路线33.3 分析方法43.3.1 样品制备43.3.2 标准溶液43.3.2.1 标准储备液43.3.2.2 标准工作溶液43.3.3 液相色谱-蒸发光检测器分析条件53.3.4 样品含量的测定与计算53.3.5 混合标准工作溶液和样品溶液典型色谱图64. 结果与讨论74.1 样品量的选择74.2 萃取条件优化74.2.1 萃取溶剂的选择74.2.2 萃取方式的选择114.2.3萃取体积的选择114.2.4 萃取时间的选择124.3 空白和干扰试验124.4 标准溶液稳定性试验134.5 前处理实验条件小结134.6 高效液相色谱蒸发光检测器分析方法144.6.1 LC分析条件144.6.1.1 色谱柱的选择144.6.1.2 流动相的选择154.6.1.3 流速的选择154.6.1.4 柱温的选择154.6.2 ELSD参数的确定164.6.2.1 漂移管温度的选择164.6.2.2 氮气流量的选择164.6.2.3 增益的选择174.7 方法评价184.7.1 标准曲线线性、检出限和定量限184.7.2 重复性试验184.7.3 回收率试验214.7.4 与行业推荐标准方法的比对224.7.5 再现性试验（不同地区实验室间的比较）235. 检测实例24参考文献27烟草及烟草制品 麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的测定 高效液相色谱蒸发光检测器法试验报告1. 综述烟草中的水溶性糖与烟草的吃味、香味特征和焦油生成量关系密切，测定其含量对配方设计、工艺生产、烟草品质控制及卷烟降焦减害具有十分重要的意义。麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖是烟草中重要的水溶性糖。麦芽糖和蔗糖在酸性条件下，可水解为2分子的单糖，是重要的烟草二糖。对于糖的测定方法，早期主要采用纸色谱法、薄层色谱法、化学法、比色法、酶法、碘量法等经典方法进行混合糖(总糖)的分析，这些方法分辨率低、分析时间长、定量困难、难以实现自动化操作。我国烟草行业中常用的方法有芒森 .沃克法、连续流动分析法和近红外（NR）光谱法，这几种方法均是以葡萄糖含量来计算烟草中水溶性糖的总量（或还原糖的百分含量）。气相色谱也可用于糖的测定，但由于其需要衍生化操作，步骤繁琐、耗时较长，现在测定糖类物质很少采用气相色谱法。对糖类物质的直接测定法目前主要有高效液相色谱法、离子色谱法和高效液相色谱-质谱联用法，这三种方法都无需进行柱前衍生化操作。HPLC-MS分析糖类物质灵敏度高、分析速度快，非常适合痕量分析。由于烟草和烟草制品中麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量较高，无需使用高灵敏度的HPLC-MS法。离子色谱也较多的应用于烟草中糖的测定，也可以达到较低的检测限，适用于对微量糖类物质的测定。由于其灵敏度较高，检测前需对样品进行较大倍数的稀释，且分析时间较长，平均测试一个样品需要1小时，甚至更长的时间，不利于检测效率的提高，所以高效液相色谱法是目前采用较多的检测糖的方法16。高效液相色谱法测定水溶性糖，目前使用较多的检测器是示差折光检测器和蒸发光检测器。示差检测器易受溶剂前沿峰的干扰使分析复杂化，对温度敏感，导致基线不稳定。蒸发光检测器是上世纪八十年代发展起来的新型通用型检测器，响应不依赖于样品的光学特性，不受其官能团的影响，挥发性低于流动相的样品均能被检测，可获得稳定的基线，使分辨率更好 7。所以项目组在充分查阅国内外相关资料和大量的试验的基础上，欲建立烟草及烟草制品中麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的高效液相色谱蒸发光检测器（HPLC- ELSD）方法，以期使高效液相法测糖的准确性更好，检测效率更高。2. 实验原理2.1 实验原理烟草及烟草制品样品用0.02mol/L氢氧化钠溶液萃取后，采用蒸发光检测器的高效液相色谱测定样品的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖，外标法定量。2.2 蒸发光检测器工作原理7检测原理(Principle Of Operation)蒸发光散射检测器的独特检测原理包括以下三个步骤：首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。雾化(Nebulization) 蒸发(Evaporation) 检测(Detection) 1 雾化(Nebulization) ：经HPLC 分离的柱洗脱液进入雾化器，在此与稳定的雾化气体（一般为氮气）混合形成气溶胶。气溶胶由均匀分布的液滴组成，液滴大小取决于分析中采用的气体流量。气体流量越低形成的液滴越大，液滴越大则散射的光越多，从而提高了分析灵敏度，但是越大的液滴在漂移管中越难蒸发。每种方法均存在产生最佳信号噪音比率的最优化气体流量。2 蒸发(Evaporation)：气溶胶中挥发性成分在加热的不锈钢漂移管中蒸发。为特定应用设置适当的漂移管温度，取决于流动相的组成和流速，以及样品的挥发性。最佳温度需要通过观察各温度时的信号噪音比率来确定。3 检测(Detection)：悬浮于流动相蒸汽中的样品颗粒从漂移管进入到光散射检测池。在检测池中，样品颗粒散射激光光源发出的光，而蒸发的流动相不散射。散射光被硅光电二极管检测。3. 材料与研究方法3.1 仪器及试剂（1）1100 HPLC，配备G1378B脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器，G1316A柱温箱（美国Agilent公司）和 蒸发光检测器（美国Alltech公司）；（2）Milli-Q Exlix 5 纯水机（美国Millipore公司）；（3）HY-8回旋振荡器（国产，常州国华电器有限公司）；（4）德国Sartorious电子天平ME414S；（5）蔗糖，D(-)-果糖，D-(+)-无水葡萄糖和麦芽糖（美国Sigma-Aldrich公司）；（6）氢氧化钠（分析纯）；（7）乙腈（色谱纯）；（8）水（符合GB/T 6682中一级水的规定）；（9）其它实验室通用玻璃器皿。3.2 研究路线（1） 样品准备：抽样方法及实验前准备工作；（2） 样品前处理方法的确定：称取样品量、萃取溶剂、萃取方式、萃取体积、萃取时间的优化；（3） 高效液相色谱条件的选择：色谱柱的确定，流动相的确定，流速的确定，柱温的确定，洗脱条件（等度、梯度）等的优化；ELSD参数的选择：漂移管温度的确定，氮气流量的确定，增益的确定；（4） 空白和干扰试验；（5） 标准溶液的稳定性试验；（6）标准曲线（确定曲线工作范围），检出限、定量限的确定；（7）重复性（包括日间重复性和日内重复性）试验；（8）回收率检测：分低、中、高三个浓度水平检测回收率；（9）不同方法检测结果比对实验：与离子色谱法，高效液相（示差折光）法的比较；（10）对比实验（不同地域实验室数据对比）；（11）实际样品检测。3.3 分析方法3.3.1 样品制备称取1 g试样，精确至0.0001 g，置于100 mL磨口锥形瓶中，加入30 mL 0.02mol/L氢氧化钠溶液，振荡浸提40 min。过滤，取2mL滤液过022mm水系滤膜，进行HPLC分析。3.3.2 标准溶液3.3.2.1 标准储备液称取果糖、葡萄糖0.6 g、蔗糖0.2 g、麦芽糖0.09 g，用水溶解定容于100毫升容量瓶中。配制成果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量分别为6000 µg/mL、6000 µg/mL、2000 µg/mL和900 µg/mL的混合标准储备液。本储备液应在0 - 4条件下贮存，并应在一个月内使用。3.3.2.2 标准工作溶液等倍稀释混合标准储备液，配制成以下浓度系列标准工作液（见表1）。表1 标准工作溶液浓度系列果糖（µg/mL）葡萄糖（µg/mL）蔗糖（µg/mL）麦芽糖（µg/mL）188188632837537512557750750250113150015005002253000300010004506000600020009003.3.3 液相色谱-蒸发光检测器分析条件 色谱柱：Prevail Carbohydrate ES (250 mm×46 mm id，5 mm)，预柱(4.6*7.5mm)，GRACE公司；流速：0.8 mL /min；柱温：20；进样量：10mL；等度洗脱：水：乙腈 = 28%:72%；氮气流量：2.2L/min；漂移管温度：50；增益：1；3.3.4 样品含量的测定与计算（1）标准工作曲线绘制对各糖峰面积的对数与其相应的标准溶液浓度的对数进行线性回归，得到线性回归方程。 （2）样品的测定滤液（3.3.1）按照仪器测试条件（3.3.3）测定样品，每个样品平行测定两次。样品中麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的含量按式（1）计算： （1）式中：X 样品中麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的含量，单位为百分比(%)；c 样品溶液中麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的测定浓度，单位为微克每毫升(mg/mL)；V 萃取液的体积，单位为毫升(mL)；m 样品的质量，单位为克(g)；样品水分的质量分数，单位为百分比（%）。结果以两次平行测定值的算术平均值表示，精确至0.01%。两次平行测定结果的相对平均偏差不应大于5.0%。3.3.5 混合标准工作溶液和样品溶液典型色谱图按照3.3.1、3.3.2进行样品处理和标准溶液的配置后，以3.3.3分析条件进行LC-ELSD分析，得混合标准工作溶液和样品溶液典型色谱图（见图1、图2）。图1 混合标准工作溶液典型色谱图图2 样品溶液典型色谱图4. 结果与讨论4.1 样品量的选择为考察取样量对检测结果的影响, 称取四个不同的样品量进行重复性实验。分别称取0.5g、0.8g、1.0g、1.2g，按照3.3.1所述方法处理样品后上机分析，每个样品量重复5次，测定结果见表2。表2 样品量选择称样量(g)果 糖RSD%(n=5)葡萄糖RSD%(n=5)蔗 糖RSD%(n=5)麦芽糖RSD%(n=5)0.51.381.943.939.140.80.731.373.196.191.00.590.592.572.581.20.811.221.862.48由表2可知：随着样品量的加大，检测结果变异系数逐步变小，但在1.0 g以后，变异系数变化不明显。因此，本实验选定1.0 g 作为称取样品量。4.2 萃取条件优化为保证萃取的充分性和有效性，降低样品对检测结果的影响，有必要对萃取条件进行优化。本试验考察了萃取溶剂、萃取体积、萃取方式和萃取时间的影响。4.2.1 萃取溶剂的选择国内外各资料中提取烟草中水溶性糖的试剂主要有水12 和0.01 mol/L NaOH8水溶液，二者对四种糖的提取效率相当。由于烟草中含有多种酸，烟草样品的水提取液也呈偏酸性，其中的柠檬酸、酒石酸等酸性物质可催化蔗糖分解，不利于样品提取液的长时间放置，对于蔗糖含量较高的样品，蔗糖的分解更为明显。根据德国标准DIN 10371-2001方法（1.000g样品，50mL 0.01 mol/L NaOH萃取），结合本实验称样量（1.000g）、萃取液体积（用30 mL萃取液萃取样品时，各糖可萃取完全）以及烟草中酸性物质的实际情况，选择水、0.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03 mol/L NaOH作为萃取液。比较使用这四类萃取液萃取后，样品在22小时内的稳定性（见表3、4、5、6和图3、4）。表3 样品用水萃取22小时内检测结果时间果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麦芽糖(%)0 7.86 5.60 2.87 0.24 2 7.86 5.75 2.77 0.26 4 7.81 5.79 2.68 0.25 6 7.88 5.84 2.62 0.23 8 7.83 5.89 2.64 0.25 10 8.13 6.12 2.56 0.22 12 7.97 5.95 2.46 0.22 14 7.96 5.92 2.38 0.21 16 7.95 5.99 2.31 0.20 18 8.04 6.01 2.24 0.20 20 8.03 6.04 2.14 0.20 22 8.07 6.05 2.03 0.19 平均值7.96 5.91 2.47 0.21 变异系数1.30 2.52 10.53 11.70 表4 样品用0.017mol/L NaOH萃取22小时内检测结果时间果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麦芽糖(%)0 7.80 5.65 2.84 0.24 2 7.74 5.65 2.79 0.27 4 7.74 5.71 2.69 0.22 6 7.72 5.70 2.63 0.23 8 7.78 5.81 2.62 0.22 10 7.85 5.86 2.60 0.21 12 7.84 5.76 2.46 0.22 14 7.87 5.89 2.42 0.22 16 7.91 5.94 2.36 0.20 18 7.92 5.93 2.28 0.24 20 7.92 5.81 2.22 0.26 22 7.93 5.68 2.17 0.21 平均值7.83 5.78 2.51 0.20 变异系数0.98 1.84 8.91 10.62 表5 样品用0.02mol/L NaOH萃取22小时内检测结果时间果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麦芽糖(%)0 7.79 5.66 2.94 0.25 2 7.70 5.66 2.83 0.26 4 7.70 5.67 2.81 0.26 6 7.70 5.72 2.77 0.24 8 7.66 5.75 2.80 0.24 10 7.83 5.83 2.72 0.21 12 7.77 5.79 2.65 0.22 14 7.83 5.82 2.60 0.23 16 7.83 5.79 2.57 0.22 18 7.83 5.73 2.47 0.22 20 7.78 5.71 2.41 0.23 22 7.81 5.62 2.27 0.24 平均值7.77 5.73 2.66 0.22 变异系数0.79 1.23 7.43 7.31 表6 样品用0.03mol/L NaOH萃取22小时内检测结果时间果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麦芽糖(%)0 7.78 5.67 2.87 0.26 2 7.65 5.62 2.88 0.25 4 7.66 5.64 2.86 0.26 6 7.68 5.71 2.91 0.22 8 7.72 5.80 2.89 0.20 10 7.70 5.77 2.82 0.19 12 7.72 5.70 2.80 0.24 14 7.72 5.73 2.79 0.25 16 7.76 5.68 2.76 0.22 18 7.70 5.69 2.72 0.23 20 7.57 5.70 2.51 0.22 22 7.56 5.68 2.47 0.24 平均值7.60 5.63 2.78 0.23 变异系数0.88 0.92 5.24 9.82 图3 不同萃取液中三种糖随放置时间的变化图4 不同萃取液中麦芽糖随放置时间的变化稳定性实验分析： 22小时内，由于糖类物质的水解，果糖、葡萄糖在四种萃取液中均呈上升趋势；麦芽糖在四种萃取液中的变化幅度在10%之间，较稳定；蔗糖在22小时内均呈下降趋势。分别对10小时内和22小时以内的检测结果进行分析：10小时时：蔗糖在水、0.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取液中的检测值分别为初始值的： 90.0%、91.6%、96.3%和98.3%。22小时时：蔗糖在水、0.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取中的检测值分别为初始值的：71.8%、76.5%、77.3%和86.1%。用0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取样品时，果糖、葡萄糖和蔗糖在10小时内的变化值小于5%，麦芽糖变化值在10%以内，可认为用这两种萃取液的稳定时间为10小时。为确保对蔗糖的准确定量，考虑到萃取样品后的pH应在7左右，选择0.02 mol/L NaOH为样品的萃取溶液，制备的样品需在10小时内检测。该时间与德国标准DIN 10371-2001一致。4.2.2 萃取方式的选择在确定了萃取液后，为选择合适的前处理方式，本实验比较了超声（60Hz）和机械振荡（180 r/min）两种萃取方式。分别称取1g试样六份，前三份用超声萃取，后三份用机械振荡萃取，两者的分析结果见表7：表7 超声和振荡萃取方式的结果比较萃取方式果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)振荡7.83 5.60 3.03 0.17 超声8.19 5.87 3.13 0.17 果糖、葡萄糖和蔗糖的超声比振荡检测结果高，分别较振荡高4.6%、4.8%和3.3%，对于麦芽糖两种萃取方式无差别，故超声和振荡对四糖的萃取效果无显著差别。基于超声萃取过程中，溶液混浊，过滤速率慢，噪音较大，最终选择机械振荡方式萃取样品。4.2.3萃取体积的选择在确定了萃取液和萃取方式的基础上，为了使样品中四种糖较好的萃取和检出，根据称样量，进行了萃取液体积选择实验：称取样品12份，称样量1g（精确至0.0001g）,分别加入20mL、30mL、40mL、50 mL 、60 mL 、80 mL的萃取液，检测结果比较如下： 图5 不同萃取体积萃取效率的比较由图5可知，萃取液中的四糖含量随萃取液体积的增大而增加，在30mL后趋于稳定，即30 mL时萃取基本完全，且此时四糖含量最大，利于检测。故选择萃取液体积为30mL。4.2.4 萃取时间的选择在前期条件确定的基础上，分别称取1g试样10份，对样品进行10 min、20 min、 30 min、40 min、50 min的振荡萃取后，对比检测结果（见图6）：由图6可知， 40 min后样品含量趋于稳定，说明40 min时样品萃取完全，故选择萃取样品的时间为40 min。图6 不同振荡时间的比较图4.3 空白和干扰试验不加入样品和标准品，按样品前处理方法进行空白试验。由图7可见，空白色谱图基线稳定，在葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖出峰处无干扰峰。故本实验无需进行空白扣除。图7 空白样色谱图为排除烟草及烟草制品中其它性质相近物质的干扰，在本方法下对鼠李糖、半乳糖、甘露糖、丙二醇、甘油、木糖醇和山梨醇进行了分析，如图8所示：在果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的出峰位置上，不存在以上各物质的干扰。图8 七糖标（兰色）、木糖醇（紫红色）、丙二醇（未出峰）、甘油（红色）、山梨醇（绿色）检测图谱4.4 标准溶液稳定性试验按3.3.2.1配制的标准储备液，该储备液于4冰箱中避光保存，并在0、15、20、30天时测定标准储备液中四糖的含量，试验结果见表8。由表8可知，30天内该标准储备液的相对标准偏差在1%以内，即该标准储备液在30天内稳定性较好。表8 标准储备液稳定性放置时间（天）果糖（mg/mL)葡萄糖（mg/mL)蔗糖（mg/mL)麦芽糖（mg/mL)05.985.982.010.90156.025.992.000.89206.016.041.990.89305.976.021.980.89相对标准偏差（%）0.400.460.650.564.5 前处理实验条件小结- 称取样品量为1.0g；- 萃取溶剂为0.02 mol/L NaOH水溶液；- 萃取方式为机械振荡；- 萃取液体积30 mL；- 振荡时间为40分钟，转速180 r/min。4.6 高效液相色谱蒸发光检测器分析方法4.6.1 LC分析条件4.6.1.1 色谱柱的选择 目前用于检测烟草中糖的液相色谱柱有两类：反相色谱柱和离子交换柱。反相柱主要有：Waters公司的高效碳水化合物色谱柱，X-bridge Amide氨基柱； Suplecosil LC-NH2；GRACE公司的Prevail Carbohydrate ES糖分析柱。离子交换柱有各种不同类型的阳离子交换柱：PL-Hi-plex Pb， PL-Hi-plex Ca等。Waters公司X-bridge 色谱柱和Suplecosil LC-NH2糖分析柱均属于硅胶基质的氨基柱。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂，常规分析pH范围为2-8。这两根柱子在蒸发光检测器使用时均存在：基线噪音大，对梯度洗脱不敏感，致使麦芽糖与杂质峰的分离较差等缺点。鉴于以上原因，一般的氨基柱在检测麦芽糖上有一定的局限性。 PL-Hi-plex Pb和PL-Hi-plex Ca均为阳离子交换柱，该柱子填料为苯乙烯-二乙烯苯（SDVB），是利用混和物中各种糖分在树脂柱上的吸附力不同而达到彼此分离的目的。其优点是耐水相，可以很好地分析果糖、葡萄糖和蔗糖。缺点是蔗糖和麦芽糖出峰位置重合，二者不能同时检测，所以该柱也不宜选用。Prevail Carbohydrate ES糖分析柱：该柱为聚合物基质的氨基柱。采用杂化键合技术，在整个pH范围内稳定。其较强的疏水性和整个pH范围内的稳定性，以及高碳载量（15%，一般氨基柱为3.5%-8%），避免了普通硅胶基质的氨基柱在水相流动相中的柱流失严重和不能耐受高pH值，以及易和葡萄糖、果糖、麦芽糖等还原性糖形成Schiff碱的缺点。该柱在水相流动相中，不会发生降解，与所有检测器联用（包括ELSD）基线都平稳，是较理想的糖类物质分析柱。最终选择Prevail糖柱为本实验色谱分析柱。4.6.1.2 流动相的选择据资料9 10 11，测定糖的流动相多为乙腈和水，当二者为流动相体系时，流动相中水的比例增加，有利于糖的溶解，分析时间变短，但水的比例过大（大于30%）时，不利于流动相在漂移管内的汽化，噪声增大，灵敏度降低，导致组分峰保留时间接近，木糖和果糖，甘露糖和葡萄糖不能实现基线分离，影响到果糖和葡萄糖的准确定量；乙腈在流动相中的比例增大时，可有效改善色谱峰形，有利于各组分的基线分离，但不利于糖的溶解，分析时间也显著增长。综合考虑以上因素，在比较不同等度比例和梯度洗脱比例的基础上，选择四种糖最佳洗脱条件，最终确定等度洗脱： V水：V乙腈=28：72 。4.6.1.3 流速的选择确定了流动相比例之后，选择在0.6 mL /min、0.8 mL /min和1.0 mL /min的流动相流速下分析样品。由于流动相中水含量较高，流速为1.0 mL /min时，柱压过高（应小于2200psi）；流速为0.6 mL /min时，出峰较慢，峰型较宽，分析时间较长；流速为0.8 mL /min时，可以在20分钟内完成对四种糖的分析，峰型尖锐，分离度良好，故选择流速为0.8 mL /min。4.6.1.4 柱温的选择在前期条件确定的基础上，考虑到低温时糖溶解度降低，高温下还原糖易水解的特性，在柱温范围（4-50）内设定六个温度，考察标准品中目标物分离测定情况。柱温分别为： 15、20、25、30、35、40, 结果见表9。果糖、蔗糖和麦芽糖的响应值随着柱温的升高而增加，柱温超过35后,二糖的水解加速,蔗糖与麦芽糖的峰面积明显减小。葡萄糖的响应值随着柱温的升高而降低。综合考虑响应值的高低，以及35后基线不稳定等因素，确定柱温为20。表9 不同柱温度时四糖峰面积检测结果温 度（）果 糖葡萄糖蔗 糖麦芽糖15 1798.91382.1751.7152.220 1862.21398.2775.1158.025 1959.71390.8810.5159.130 2148.71342.3927.7169.035 2368.61342.11095.0178.340 2627.91128.11026.8 139.14.6.2 ELSD参数的确定4.6.2.1 漂移管温度的选择漂移管温度取决于流动相的组成和流速，以及样品的挥发性。漂移管温度影响检测器的响应，温度升高，流动相挥发趋于完全，信噪比上升。高有机含量流动相比高含水量流动相蒸发所需要的漂移管温度低。最佳温度需要通过观察各温度时的信号噪音比率来确定。根据流动相的种类和比例，首先设氮气流速2.2 L/min，保持气流速不变，设置漂移管温度分别为48、50、52和55，观察样品测定情况，比较见表10，温度为50时，流动相基本挥发，各糖峰面积最大，故选择漂移管温度为50。表10 不同漂移管温度下四糖峰面积的比较温度（。C）果糖葡萄糖蔗糖麦芽糖4821386.714826.93988.341.65025682.817774.26560.180.25221401.614796.24100.547.35520333.814061.53773.745.14.6.2.2 氮气流量的选择雾化载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应。气体流量越低形成的液滴越大，液滴越大则散射的光越多，从而提高了分析灵敏度，但是液滴越大在漂移管中越难蒸发，基线噪音也随之变大。在固定漂移管温度为50后，比较不同氮气流速时四糖的信号强度及基线噪音情况，图9依次为氮气流速2.0 L/min、2.2 L/min、2.5 L/min时的检测情况。当流速为2.0 L/min 时，基线噪音明显；当流速为2.2 L/min和2.5 L/min时基线较为平稳，噪音较小，各峰峰型良好，麦芽糖峰面积分别为45.7和29.8，流速为2.2 L/min较2.5 L/min时，麦芽糖峰面积高出53%。故选择氮气流速为2.2 L/min。图9 不同漂移管温度下基线噪音的比较图4.6.2.3 增益的选择在确定了漂移管温度和载气流速之后，适当增加增益可以提高低含量物质的响应值。分别设置增益为1、2、4检测样品（见图10）。虽然增益2时，可以增大麦芽糖的响应值，但由于葡萄糖、果糖含量较高，增益2时，葡萄糖、果糖峰出现分裂峰，峰型变宽，故最终选择增益为1。图10 不同增益值时果糖峰顶图4.7 方法评价4.7.1 标准曲线线性、检出限和定量限将最低浓度的标准溶液平行测定10次后，采用外标法定量，计算其标准偏差，分别以3倍和10倍标准偏差对应的浓度值为测定方法的检出限和定量限（见表11）。结果表明，方法的线性良好，相关系数均大于0.999，该方法灵敏度较好。表11 标准曲线的线性方程、相关系数、检出限、定量限名称线性方程相关系数检出限（mg/L）定量限（mg/L）果糖y = 1.6596x +8.04990.9997723葡萄糖y = 1.5966x +8.00530.9994516蔗糖y = 1.6548x+8.08580.9995414麦芽糖y = 1.3905x +7.12320.99966194.7.2 重复性试验按3.3.1 处理方法对高、中、低三个含量的试样A、B、C在1日内进行6次平行测定和检测五天的结果，得方法日内精密度（见表12、13、14）和日间精密度（见表15、16、17），以RSD%表示。果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的日内精密度小于2%，日间精密度小于3，说明该方法在日内和日间均具有良好的重复性。表12 试样A日内精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)18.045.942.910.3128.005.812.870.3237.975.822.900.3148.035.822.850.3158.025.842.830.3168.025.912.890.31平均值8.015.862.870.31标准偏差0.020.050.030.01变异系数0.310.941.041.63表13 试样B日内精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)14.972.670.490.3424.972.690.460.3330.000.000.480.3444.982.710.490.3455.102.740.490.0065.062.750.490.34平均值5.022.710.480.34标准偏差0.060.040.010.00变异系数0.120.130.290.12表14 试样C日内精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)12.461.330.000.0022.431.340.000.0032.381.320.000.0042.401.310.000.0052.471.370.000.0062.351.350.000.00平均值2.411.340.000.00标准偏差0.050.020.000.00变异系数1.981.810.000.00表15 试样A日间精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)18.155.862.760.2928.025.912.820.2838.085.922.800.2748.115.902.850.2957.995.802.900.29平均值8.075.882.830.28标准偏差0.070.050.050.01变异系数0.830.821.932.74表16 试样B日间精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)15.022.840.490.3724.932.770.490.3734.982.780.500.3844.952.800.480.3754.942.790.500.37平均值4.962.800.490.37标准偏差0.040.020.010.01变异系数0.790.871.421.82表17 试样C日间精密度试验结果测定次数果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麦芽糖（)11.450.980.000.0021.531.030.000.0031.480.980.000.0041.491.000.000.0051.541.040.000.00平均值1.501.010.000.00标准偏差0.040.030.000.00变异系数2.452.720.000.004.7.3 回收率试验对高、中、低含量的试样A、B、C，以其五次平行测定的平均值作为计算其果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖原始含量的依据。分别添加高、中、低三个浓度水平的标准物质，进行回收率试验（见表18、19、20）。由表可见，在不同含量的试样中，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的回收率在 97107之间，结果符合方法要求。表18 试样A回收率试验结果化合物添加水平原值（mg)加标量(mg)测定值(mg)回收率果糖低