HPLC法测定返魂草中4羟基苯乙酸的含量.doc
HPLC法测定返魂草中4羟基苯乙酸的含量苗艳平1，苗艳波2，张宪平3（1.长春中医药大学，长春，130117；2.吉林省中医药科学院，长春130021；3.吉林省食品药品检验所，长春 130033）摘要 目的 建立返魂草中4羟基苯乙酸的含量HPLC法。方法 外标法，DiamonsilTMC18色谱柱(5m，4.6mm×250mm)，流动相为甲醇-水-冰醋酸（14：86：1）混合液；检测波长为224nm。流速1.0mL·min-1。结果 4羟基苯乙酸的线性范围为43.14ng-862.8ng（r=0.9999），平均回收率为99.0%，RSD=0.4%(n=6)。结论 方法准确、简单，可作为返魂草中4羟基苯乙酸的定量分析方法。 关键词 返魂草；4羟基苯乙酸；高效液相色谱 Determination of 4Hydroxyphenylacetic Acid in Herba Senecio Cannabifolius by HPLCMiao Yanping1,Miao Yanbo2, Zhang Xianping 3（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine ,Changchun 130033；2.Jilin Provical Academy of Traditional Chinese Medical and Drug Science ,Changchun 130021 ；3Jilin Provical Institute for Food and Drug Control ,Changchun 130033）Abstract Objective To determine the content of 4hydroxyphenylacetic acid in herba senecio cannabifolius by HPLC. Methods An external standard method by HPLC with DiamonsilTMC18 column as fixed phase and a mixture of methanol, water and glacial acetic acid（14:86:1）as the mobile phase was adopted. The detection wavelength was 224nm and the flow rate was 1.0mL·min-1.Results The linear range for gastrodin was 43.14ng-862.8ng，（r=0.9999）.The average recovery of the sample was 99.0% and RSD was 0.4% (n=6). Conclusion The method is simple and accurate， which can be adoptable for quantitative analysis of 4hydroxyphenylacetic acid in herba senecio cannabifoliusKey words Herba Senecio Cannabifolius; 4Hydroxyphenylacetic Acid;HPLC 返魂草为菊科千里光属植物Senecio cannabifolius Less.的干燥地上部分1。包括单叶返魂草Senecio cannahifolius Less. Var. integrifolius(Koidz.) Kitag.和宽叶返魂草(又名麻叶千里光，Senecio cannabifolius Less.)。具有清热解毒，散血消肿，下气通经，清热祛痰,镇咳平喘。用于淤血肿痛，跌打损伤，肺内感染，慢性支气管炎，喘息性支气管炎，急性呼吸道感染等症2。为更好的控制返魂草药材质量，本文采用4羟基苯乙酸作为测定对象，建立了用HPLC测定返魂草中4羟基苯乙酸的方法。 1 仪器、试剂和样品 岛津LC-2010CHT全自动高效液相色谱仪，CLASS-VP色谱工作站；4羟基苯乙酸（C8H8O3）对照品（批号：140736-200501；含量：98.5；规格：约10mg/支）由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为优级纯；水为自制超纯水；其他均为分析纯。样品提供：吉林敖东力源药业股份有限公司。2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱：钻石C18(5m，4.6mm×250mm)；流动相：甲醇-水-冰醋酸（14：86：1）混合液；流速：1.0mL·min-1；柱温：30；检测波长为224nm；理论塔板数按4羟基苯乙酸峰计算，应不低于8000。 2.2.1 对照品溶液的制备 取4羟基苯乙酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含 40g的溶液，即得。2.2.2供试品溶液的制备取本品中粉约5g，精密称定，精密加水100mL，称定重量，加热回流提取3小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液15ml，浓缩近干，残渣加甲醇研磨使溶解，转移至5ml量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.2.3测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，即得。 A B A供试品、B对照品图1 高效液相色谱图2.3 标准曲线和检出限及定量限 取4羟基苯乙酸对照品溶液(43.14g/ml)。分别精密吸取1，5，10，15，20Ll进样，结果进样量在43.14ng-862.8ng范围内，回归方程为Y=6266.7X1369.5，r=0.9999。检测限为0.4ng；定量限为1.3ng。 2.4 仪器精密度和样品稳定性、重复性试验 2.4.1精密度试验 精密吸取同一样品溶液10L，注入HPLC仪，重复进样6次，测定对照品溶液峰面积积分值，结果RSD=0.8%。2.4.2稳定性试验 精密量取同一供试品溶液在0h、2h、4h、7h、12h、21h进样10µL，以4羟基苯乙酸峰面积的相对标准偏差反映样品的稳定性，结果RSD=1.0%。2.4.3 重复性试验 取同一批号样品依含量测定项下方法独立制备6份供试品，分别依法测定，结果RSD=1.4%。2.5 准确性试验 取样品（0.0225%）适量，研细，精密加入4羟基苯乙酸对照品溶液（每1mL含4羟基苯乙酸0.1438mg）4mL，精密加水50mL，按质量标准含量测定项下方法测定，进样10µL，共6份，进行回收率试验，结果见表1。表1 准确性试验结果样品称取（g）样品含4羟基苯乙酸（mg）加入4羟基苯乙酸对照品（mg）实际测得（mg）回收率（）均值和RSD2.35310.52940.57521.097698.78X=99.0RSD=0.4%2.43390.54760.57521.116498.892.49010.56030.57521.129098.872.49270.56090.57521.128498.662.50020.56250.57521.130798.782.55680.57530.57521.148999.722.6 取样品，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液后，精密吸取供试品溶液10L，按2.1项下色谱条件测定，用外标法计算返魂草中4羟基苯乙酸的含量，结果见表2 表2 6批样品4羟基苯乙酸含量测定结果 批号含量 ()批号含量()0809010.0220809060.0170809050.0200809070.0170801010.0250812010.0223.讨论 3.1 返魂草主要含有25对羟基苯乙酸(4羟基苯乙酸)、对羟基苯乙酸甲酯，对羟基苯甲酸、5羟基吡啶2甲酸甲酯（E13）、senecine、绿原酸、香草酸、咖啡酸等。张玲、刘艳清和弥宏等68曾经对其中的绿原酸进行了含量测定。本文为首次采用HPLC法以4羟基苯乙酸为定量指标进行含量测定。 3.2测定波长的选择 根据4羟基苯乙酸对照品的流动相溶液的紫外吸收光谱扫描图，显示在278nm和224nm波长处有最大吸收，但在224nm波长处响应值明显高于278nm波长处响应值，最终确定224nm为本法的测定波长。3.3 对流动相进行了筛选。以甲醇-水-冰醋酸（14：86：1）混合液，甲醇-1%冰醋酸（30：70）混合液。方法分离效果不好。方法分离效果较好，保留时间适中，故选择其作为本文方法。3.4 专属性 取供试品溶液，按正文条件采用二极管阵列检测器检查4羟基苯乙酸峰纯度，结果表明峰纯度较好，无杂质峰包埋。参考文献1中华人民共和国卫生部药典委员会 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂 第四册 一九九一 附录2严仲铠，李万林主编 中国长白山药用植物彩色图志 人民卫生出版社 1997年10月第1版3马鸿雁，杨莉等，单麻叶千里光中的一个新化学成分 药学学报 2008，43（6）626629；4吴斌，吴立军等 麻叶千里光抗菌化学成分的研究（） 沈阳药科大学学报 2004，21（5）3413445吴斌，吴立军等 麻叶千里光抗菌化学成分的研究（） 中草药 2005，36（10）144714506 张玲，初洪波等 复方返魂草片质量标准研究 黑龙江医药2009，1，67 刘艳清 鲁湘鄂等 返魂草颗粒中绿原酸含量研究 肇庆学院学报, 2007(2): 54578 弥宏 , 杨军等 返魂草胶囊中绿原酸的含量测定 中国中医药科技, 2006，6致谢 感谢吉林省中医药管理局下属五味子油返魂草提取物的制备工艺及质量标准规范化研究课题（课题号2010-TT008）对本实验的大力资助。个人简介：苗艳平 女 本科 1971年3月 研究方向：药物分析 邮箱：jlsccsmyp 电话：13596058045
