大白菜甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定.doc

园 艺 学 报 2014，41（7）：13551360 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140414；修回日期：20140603 基金项目：国家科技支撑计划项目（2013BAD20B06） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xyjho） 大白菜甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定 李丹丹，李雪红，彭 莹，方小雪，万正杰，徐跃进* （华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070） 摘 要：以甘蓝型油菜作为母本，大白菜作为轮回父本，杂交获得BC1和BC2群体。通过染色体核型分析法从BC2群体中筛选出大白菜甘蓝型油菜C基因组6号单体异附加系，利用甘蓝型油菜C连锁群特异SSR标记鉴定，确定该单体异附加系中的外源染色体与甘蓝型油菜C6连锁群相对应。 关键词：大白菜；甘蓝型油菜；单体异附加系；核型分析；SSR 中图分类号：S 634.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1355-06 Generation and Identification of Chinese CabbageCabbage Type Rape Monomer Alien Addition Line LI Dan-dan，LI Xue-hong，PENG Ying，FANG Xiao-xue，WAN Zheng-jie，and XU Yue-jin* （College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University；National Center for Vegetable Improvement，Centeral China；Key Laboratory of Horticulture Plant Biology，Ministry of Education，Wuhan 430070，China） Abstract：In this experiment，BC1 and BC2 populations were derived from a distant hybridization between cabbage type rape（Brassica napus）and Chinese cabbage（B. compestris ssp. pekinensis），using the latter as recurrent parent. A Chinese cabbage with cabbage type rape monosomic alien addition line was identified from the BC2 population through karyotype analysis. SSR marker analysis showed that the monosomic alien addition line was introduced from C-chromosome 6 of cabbage type rape. Key words：Chinese cabbage；cabbage type rape；monosomic alien additional line；karyotype analysis；SSR 将大白菜（Brassica compestris ssp. pekinensis）近缘植物中的优异基因引入其中，是增加其遗传多样性和改良品种的重要途径。甘蓝型油菜（Brassica napus）是大白菜的近缘种，具抗病性强的特点，同时本试验中所用的材料EruA为优良的细胞质雄性不育材料，将其胞质不育基因转移到大白菜中，将有利于大白菜的育种研究。已有研究表明，芸薹属作物A与C两个基因组的染色体具有较强的同源性（Snowdon et al.，1997；刘爱华 等，2003），为引进甘蓝型油菜的优良性状，创建大白菜异附加系提供了基础。目前有关大白菜异附加系的创建主要集中在大白菜与结球甘蓝上（顾爱侠 等，2009；吕文欣 等，2011），而对大白菜与甘蓝型油菜异附加系的研究尚未见报道。 1356 园 艺 学 报 41卷 本研究中用甘蓝型油菜细胞质雄性不育系EruA作为母本、大白菜自交系D506作为轮回父本，在蕾期杂交获得F1、BC1和BC2群体，通过染色体压片从BC2群体中成功筛选出大白菜甘蓝型油菜单体异附加系，并运用核型分析和SSR分子标记进行了鉴定。 1 材料与方法 1.1 试验材料 材料为甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料EruA和大白菜自交系D506，种植于华中农业大学蔬菜试验基地，2011至2013年的34月进行蕾期杂交授粉得到F1、BC1和BC2群体（图1）。材料创建的具体流程如下： 1.2 染色体数鉴定及核型分析 取各材料的根尖或子房，在冰水混合物（16 h）或8羟基喹啉（0.002 mol · L-1，2 h）中进行预处理，后置于卡诺固定液（无水乙醇冰醋酸 = 31）中，室温下固定24 48 h，4 保存于70%乙醇中。观察时取所处理的材料用蒸馏水清洗3次后，在60 下用1 mol · L-1 HCl水解6 12 min，蒸馏水漂洗2 min之后，移植载玻片上，加1滴10%改良苯酚品红溶液，染色3 5 min，常规压片，Olympus-DP-70显微镜下观察照相。 选择体细胞染色体数为21条的植株，取5个染色体分散良好、形态和着丝点清晰的细胞，参照李懋学和陈瑞阳（1985）的核型分析方法，用SpotTM Advanced软件进行臂长测量，Photoshop软件进行同源染色体配对排列，除随体染色体外按染色体相对长度由大到小排序。与大白菜和甘蓝型油菜的核型参数（Marina et al.，1998；申书兴 等，2006；Xiong & Chris，2011）对比分析，结合镜检时的观察结果，鉴定染色体类别，确定附加染色体类型。 1.3 单体异附加系SSR分子鉴定 用CTAB法提取异源三倍体杂交种及其亲本和体细胞染色体为21条的植株的基因组 DNA。根据甘蓝型油菜的C染色体特异性标记（Piquemal et al.，2005），筛选出甘蓝型油菜C基因组连锁群相对于大白菜特异的26对SSR引物。分别对异源三倍体杂交种及其亲本大白菜、甘蓝型油菜和单体异附加系进行PCR扩增。PCR程序：94 预变性4 min；94 变性30 s，55 复性30 s，72 延伸1 min，30个循环；72 延伸7 min，4 保存。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染法检测并照相。 7期 李丹丹等：大白菜甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定 1357 2 结果与分析 2.1 单体易附加系的筛选 从表1可见，甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料EruA和大白菜自交系D506的回交一代BC1（AA + 0 9C）群体为分离群体，其染色体数从20到29不等；染色体数为22的双单体异附加系株数较多，所占比例为44%；而染色体数为21的单体异附加系并未发现。 通过染色体观察，从甘蓝型油菜EruA和大白菜D506的BC1群体中筛选出双单体异附加系BC1-31（AA + 2C），然后继续与大白菜D506回交，从其回交后代BC2群体中筛选出1株单体异附加系BC2-20（AA + 1C）（图1）。 图1 植株形态与体细胞染色体数 Fig. 1 Plant morphology and the somatic chromosome number 表1 BC1中不同染色体数单株的比例 Table 1 The proportion of individual plants in BC1 that have different number of chromosomes 染色体数 Number of chromosomes株数 Number of plants 比例/% Percentage 20 3 6 21 0 0 22 22 44 23 29 25 50 1358 园 艺 学 报 41卷 2.2 单体异附加系的核型分析 对上述BC2-20单体异附加系植株进行核型分析（图2），并与大白菜和甘蓝型油菜参数对比。BC2-20有5个中部着丝点染色体（1、3、5、6、8）、5个近中部着丝点染色体（4、7、9、10、11）和1个近端部着丝点染色体（2）组成，其中11号为附加的外源染色体，其臂比值为2.63（表2），与甘蓝型油菜C基因组6号染色体臂比值2.73（Marina et al.，1998）相近，初步确定附加的1条外源染色体为甘蓝型油菜C基因组的6号染色体。核型公式为2n = 2x + 1 = 10m + 8sm + 2st（SAT）+ 1sm。 图2 单体异附加系（BC2-20）的染色体形态及核型图 Fig. 2 Chromosome shape and karyotype of monosomic alien addition line（BC2-20） 表2 大白菜甘蓝型油菜单体异附加系（BC2-20）核型参数 Table 2 Karyotypic characteristics of Chinese cabbagecabbage type rape monosomic alien addition line（BC2-20） 染色体序号 Chromosome No. 染色体平均相对长度（L + S）/% Average relative length 臂比值（长/短） Arm ratio（L/S） 类型 Type 1 7.14 + 5.66 = 12.80 1.29 m 2 9.41 + 2.90 = 12.31 3.24 st（SAT） 3 7.72 + 4.49 = 12.21 1.52 m 4 6.25 + 3.64 = 9.89 1.91 sm 5 5.17 + 3.86 = 9.03 1.39 m 6 4.82 + 3.56 = 8.38 1.35 m 7 4.94 + 2.40 = 7.34 2.12 sm 8 4.20 + 2.71 = 6.91 1.55 m 9 4.30 + 1.90 = 6.20 2.26 sm 10 4.30 + 1.59 = 5.89 2.71 sm 11* 6.55 + 2.49 = 9.04 2.63 sm 注：随体长度不计算在内。*为异附加染色体。 Note：The satellite is excluded in the length of chromosome. * represents the alien addition chromosome. 2.3 附加染色体的SSR分子鉴定 利用甘蓝型油菜C基因组相对于大白菜特异的26对SSR引物（引物名称及连锁群对应关系如表3所示），对亲本甘蓝型油菜EruA、大白菜D506、双单体易附加系BC1-31（2n + 2）、单体异附加系BC2-20（2n + 1）进行扩增。亲本的扩增结果表明，26对SSR引物中10对引物在甘蓝型油菜中有扩增产物而在大白菜中无扩增产物，16对引物在大白菜和甘蓝型油菜中的扩增片段大小不同（如表3中的上标1、2所示）。 7期 李丹丹等：大白菜甘蓝型油菜单体异附加系的获得与鉴定 1359 表3 SSR引物名称 Table 3 The list of SSR markers used 染色体编号 Chromosome No. 连锁群 Linkage group 引物名称 Maker name C1 LG-C9 CB103441，BRAS0022 C2 LG-C1 CB100262，CB102581，CB102772 C3 LG-C5 Na10-G081，Na12-A022，CB104871 C4 LG-C3 BRAS0682，CB105691，CB103581，CB105131 C5 LG-C4 CB101031，CB102882，CB101221 C6 LG-C6 CB100101，CB102112 C7 LG-C2 Na12-A011，Na14-H111，CB103161 C8 LG-C7 BRAS0192，CB102681，CB102971 C9 LG-C8 CB101061，CB101392，CB101792 注：所用的SSR标记是从已报道的甘蓝型油菜C染色体特异性标记（Piquemal et al.，2005）中筛选的。染色体与连锁群的对应关系参考Heneen等（2012）。上标1表示引物在大白菜和甘蓝型油菜中的扩增片段大小不同；上标2表示引物在甘蓝型油菜中有扩增产物而在大白菜中无扩增产物。 Note：The SSR markers used in this study were from reported Brassica napus C-chromosome specific markers（Piquemal et al.，2005）. Correspondence between chromosome and linkage group was supported by the work of Heneen et al.（2012）. 1 represents the primers that have different sizes of amplified product between Chinese cabbage and cabbage type rape；2 represents the primers that have PCR products in cabbage type rape but not in Chinese cabbage. 从图3中单体和双体异附加系的扩增结果发现，BC1-31对位于甘蓝型油菜C基因组的1号和6号染色体连锁群的SSR引物（CB10344、BRAS002和CB10010、CB10211）扩增结果与甘蓝型油菜一致，说明BC1-31的2条外源染色体与甘蓝型油菜C基因组的6号和1号染色体连锁群相对应；BC2-20对位于甘蓝型油菜C基因组的6号染色体连锁群的SSR引物（CB10010、CB10211）扩增结果与甘蓝型油菜一致，而对位于甘蓝型油菜C基因组的1号染色体连锁群的SSR引物（CB10344、BRAS002）的扩增结果与甘蓝型油菜不同，说明BC2-20的外源染色体与甘蓝型油菜C基因组的6号染色体连锁群相对应。 图3 甘蓝型油菜C1和C6染色体连锁群特异引物的扩增结果 1：甘蓝型油菜；2：大白菜；3：BC1-31；4：BC2-20。 Fig. 3 Amplification results of cabbage type rape C1 and C6 linkage group specific primers 1：Cabbage type rape；2：Chinese cabbage；3：BC1-31；4：BC2-20. 3 讨论 前人的研究中大多是从BC1代分离群体中直接筛选单体异附加系（任艳蕊 等，2010），本研究中发现BC1代群体中单体异附加系出现的概率太低，筛选单体异附加系较为困难，而双单体异附加系出现的概率很高，再从其后代中筛选单体异附加系则相对容易。 附加外源染色体的鉴定有多种方法，如：形态学标记、染色体标记、分子标记等，其中染色体标记和分子标记鉴定是较为简单和直观的。本研究中，对筛选出的2n + 1植株进行了核型分析，并与甘蓝型油菜的核型参数对比分析表明，附加染色体臂比值（2.63）与甘蓝型油菜C基因组6号染色体臂比值2.73（Marina et al.，1998）相接近；进一步的SSR分子鉴定表明，该单体易附加系能够扩增出甘蓝型油菜C基因组6号染色体的特异条带，将该2n + 1植株确定为大白菜甘蓝型油菜C1360 园 艺 学 报 41卷 基因组6号单体异附加系，暂时编号为AA + C6。 本试验中从附加了甘蓝型油菜C基因组6号和1号染色体的双单体异附加系自交后代中只筛选出了大白菜甘蓝型油菜6号染色体单体异附加系，而没有得到1号染色体单体异附加系。分析其原因，一方面可能因为染色体的长度影响其传递率（张成合 等，2008；吕文欣 等，2011）；另一方面因为所用材料群体比较小，要想得到1号染色体单体异附加系还有待于扩大双单体异附加系回交后代群体规模。 References Gu Ai-xia，Zheng Bao-zhi，Wang Yan-hua，Xuan Shu-xin，Luo Shuang-xia，Shen Shu-xing. 2009. 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