实验十七 蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法.doc

实验十七 蛋白质分子量测定凝胶过滤层析法一、目的：（1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。（2）学习用标准蛋白质混合液制作Ve，Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。二、原理：凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。实际上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即： Vt=Vo+Vi+VgVo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积，因此VtVo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成： Kd=上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由g·WR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。以上关系可用图17-4表示。Kd可以有下列几种情况：1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质（全排阻），洗脱体积等于空隙体积（图中组分）。2、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和（图中组分）。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd都等于1，它们既使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、当0Kd1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Ve即在Vo+Vi之间变化（图中组分）。4、有时Kd1，表示凝胶对组分有吸附作用，此时VeVo+Vi。例如一些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2，1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g·WR计算，为此也常有直接用小分子物质D2O，NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav（有效分配系数）代替Kd，其定义如下：已知 Kd=，将VtVo代替Vi，则： Kav=即 Ve=Vo+Kav(VtVo)在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒（ViVo）作为固定相，而洗脱剂（VeVo）作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示： Ve=K1K2logMrK1与K2为常数，Mr为分子量，Ve也可用VeVo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化的洗脱体积，它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”，如图17-5所示。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线愈陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的分子量，测定时以使用曲线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH68的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其它方法的测定相对照，由此才可作出较可靠的结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源物质以及用于测定高分子物质的分子量。下面实验是用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子量。三、试剂及器材：1、试剂：（1）标准蛋白质混合液（各23mg·ml-1，用氯化钾-乙酸溶液配制），牛血清清蛋白（Mr67000），鸡卵清蛋白（Mr43000），胰凝乳蛋白酶原A（Mr25000）和结晶牛胰岛素（PH2时为二聚体Mr12000）等均需层析纯。（2）蓝色葡聚糖-2000（810mg·ml-1），N-乙酰酪氨酸乙酯（或硫酸铵或重铬酸钾）（810mg·ml-1）。（3）0.025mo·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，Sephadex G75（或G100），5%Ba（Ac）2。（4）待测蛋白质样品液。2器材：层析柱：柱管（直径1.01.3cm；管长90100cm），核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计，自动部分收集器，恒压瓶，下口瓶。四、操作步骤：1、一般操作方法：（1）凝胶的选择和处理凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样，流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒。将称好的干粉倾入过量的洗脱液（一般多用水，盐溶液或缓冲溶液）中，室温下放置，使之充分溶胀。注意不要过分搅抖，以防颗粒破碎。溶胀时间因凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间，可在沸水浴上加热将近100，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可以杀死细菌和霉菌，并可排除凝胶内气泡。种类凝胶溶胀时间请查阅葡聚糖凝胶的技术数据表。（2）装柱装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气。装柱方法与一般柱层析法相似。层析柱可以自制或外购，目前已有各种规格层析柱商品（图17-6）。装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约23cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过23倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。（3）加样要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量：12ml/100ml柱床容积（12%）；制备用量：2030ml/100ml柱床容积。加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约50cm处（Sephadex G-75，选用50cm液柱操作压），打开柱上端的塞子或螺丝帽，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作，用1ml洗脱液冲洗管壁2次。最后加入34ml洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连（如图17-7）。（4）洗脱洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水（多用于分离不带电荷的中性物质）及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水-甲醇、水乙醇、水-丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组分洗下。本实验洗脱用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液。洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。影响洗脱液流速的因素有：洗脱液加在柱上的压力操作压（由液面差引起）。一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小（WR7.5）的凝胶时要特别注意。为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。凝胶交联度；交联度大的凝胶（G-10至G-50型）的流速与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。交联度小的凝胶（G-75至G-200型）的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图17-8。凝胶颗粒大小：颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。（5）重装一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用34倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需竟混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。（6）凝胶的保存方法凝胶用完后，可用以下方法保存。膨胀状态：即在水相中保存。可按注意事项（9），加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用60%70%乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用95%乙醇洗，则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于6080干燥后保存。这3种方法中，以干燥状态保存为最好。2蛋白质分子量测定根据待测蛋白质的分子量范围选用Sephadex G-75或G-100型凝胶，其颗粒在40120m，柱管选用直径1.01.3cm，柱长90100cm，本实验选用1.1×100cm商品层析柱。（1）测定Vo和Vi将0.5ml蓝色葡聚糖-2000和硫酸铵混合液（2mg·ml-1）上柱、洗脱，分别测出Ve。蓝色葡聚糖的Ve即为该柱的Vo，硫酸铵洗脱体积Ve减去Vo即为柱的Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用Ba（Ac）2生成沉淀判断（若用重铬酸钾，其洗脱峰，可根据颜色判断）。（2）标准曲线的制作按上述方法将1ml标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol·L-1氯化钾-0.2mol·L-1乙酸溶液洗脱。流速3ml/10min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪280nm处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计280nm处测定每管光吸收值。以管号（或洗脱体积）为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积（Ve）。然后，以蛋白质分子量的对数1gMr为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线（图17-9）。为了结果可靠，应以同样条件重复12次，取Ve的平均值作图。同时根据已测出的Vo和Vi以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的Vt，分别求出Kd和Kav。Kd=Kav=也可以Kd或Kav为横坐标，1gMr为纵坐标作出标准曲线。（3）未知样品分子量的测定完全按照标准曲线的条件操作。五、结果与讨论：根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定12次，取其平均值，也可以计算出Kav，分别由标准曲线查得样品的分子量。注 意 事 项（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据实际需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组分移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。用于脱盐的柱一般都是短而粗，柱长（L）/直径（D）10；对分级分离用的柱，L/D值可以比较大，对很难分离的组分可以达到L/D=100，一般选用内径为1cm，柱长100cm就够了。（3）各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。（4）装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。（6）样品溶液的浓度和粘度要合适。浓度大，自然粘度增加。一个粘度很大的样品上柱后，样品分子因运动受限制，影响进出凝胶孔隙，洗脱峰形显得宽而矮，有些可分离的组分也因此重叠。（7）洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。（8）操作压过大可使流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。（9）由于葡聚糖凝胶为糖类化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠（NaN3）溶液，它极易溶于水，不与蛋白质和糖反应，也不改变它们的层析效果，也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中，可用0.05%（或0.01%0.02%）三氯丁醇溶液，但它在强碱性溶液或加热到60以上时就要分解。在弱碱性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂。因为它们能引起凝胶颗粒的收缩，同时还能进入层析仪器的塑料部件，使塑料变软，造成不良后果。（10）使用部分收集器时，将其转盘调节到最外圈，从第一管开始，否则会造成转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。凝胶层析中常遇到的故障之原因与排除方法总结见表17-1。思 考 题1根据实验中遇到的各种问题，概述做好本实验的经验与教训。2概述本法蛋白质分子量测定方法的基本理论与依据。表17-1 凝胶层析中遇到的故障、原因与排除方法故 障产 生 的 原 因排 出 的 方 法恒压瓶不能恒压1恒压瓶上口或下口橡胶塞未塞紧或橡胶塞插玻璃管处漏气1找出漏气原因，塞紧橡胶塞层析柱连接后，进水口无液体滴出2层析柱进水口或出水口的止水夹未打开3进水口塑料管中有气泡2打开止水夹3排除塑料管中的气泡层析柱出水口无液体流出4出水口的止水夹未打开5层析柱下口螺丝未旋紧，因漏气而造成出水塑料管中有气泡6出水口塑料管被凝胶阻塞4打开出水口止水夹并调节流速5找出产生气泡的原因，排除气泡6将层析柱中的凝胶倒出，冲洗尼龙网排除塑料管中的凝胶，重新装柱层析过程中流速逐渐减慢7样品中或洗脱缓冲液中含有不溶颗粒将胶床表面阻塞8操作压过高，将凝胶胶床压紧9测定内水时硫酸铵浓度太大；凝胶脱水使胶床压紧10加样时未注意恒压，加样后胶床床面下降11长期使用，微生物生长12装柱时凝胶未完全溶胀，平衡时流速即逐渐减慢13凝胶颗粒过细，或由于用暴力搅动凝胶使凝胶颗粒打碎7采用离心或过滤法除去不溶颗粒，用滴管移去柱床表面12cm的凝胶，补加新凝胶至同样高度8重新装柱，采用适当的操作压9将凝胶取出用缓冲液反复洗涤，溶胀重新装柱。适当降低硫酸铵浓度10加样时应根据操作压，将塑料管下水口抬高至相应的操作压11层析柱不用时，在平衡缓冲液中加入0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰，并使其充满柱床体积，以抑制细菌生长，暂时不用的柱应定期用缓冲液过柱冲洗，也可以防止微生物生长12将凝胶取出，待其完全溶胀后重新装柱13取出层析柱中的凝胶，用漂浮法除去过细的颗粒，重新装柱，搅拌凝胶应防止暴力层析柱胶床中有气泡14装柱前，凝胶未抽气或煮沸，在凝胶中混入空气15加样不当使空气进入凝胶胶床16从冰箱中取出凝胶或凝胶缓冲液立即装柱，或装柱后被太阳暴晒14在凝胶柱上层的气泡可用细头长滴管或细塑料管将气泡取出或赶走，并重新平衡，稳定胶床后再使用，若气泡太多则应抽气或煮沸后自然冷却后装柱15小心加样防止带进气泡16凝胶或缓冲液应放置到室温后才能装柱，避免太阳直射层析柱胶床破裂17大量空气进入层析柱18进水口流速慢，出水口流速快17找出空气进入层析柱的原因，重新装柱18找出进出水口流速不一致的原因，重新装柱故 障产 生 的 原 因排 队 的 方 法样品进入凝胶后条带扭曲19样品或缓冲液中有颗粒或不溶物20凝胶表面不平，或胶床不均匀19按方法7处理样品或缓冲液20将凝胶柱置于垂直位，轻轻搅动胶床表面12cm处的凝胶，使其自然沉降凝胶层析分辨率不高21凝胶层析柱装得不均匀22凝胶G型选择不当23加样量太大24柱床太短25样品浓度高，粘度大而形成拖尾26洗脱时流速太快27分部收集时每管体积过大21将凝胶取出重新装柱22根据欲分离物质分离的情况，选择合适的凝胶G型与粒度23为提高分辨率，分析时加样量一般为柱长的12%，最多不能超过5%24将柱床高度适当加长25根据紫外测定的光吸收值将样品适当稀释26调节洗脱的流速，（本实验为3ml/10min）27控制每管收集量，为便于紫外测定，每管收集量以2.83ml为宜分部收集时，收集盘转动一次间隔数只试管或滴管口偏离相应的试管28使用前未经定位或开始收集后随便移动转换臂，从而造成收集盘与转换臂转动不同步28将自动收集器换向开关拨向“顺”，连续按手动开关，使收集盘与转换臂同时以“顺”时针方向转至外圈零位。将换向开关拨至“逆”，使转换臂的滴管口对准第一个试管中心，打开自动开关即可进行同步收集实验十八 琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶及血清LDH总活力的测定一、目的：1学习琼脂糖聚胶电泳的原理和方法；2学习酶专一性染色原理及其应用；3掌握分离LDH同工酶的方法；4学习测定血清LDH总活力的原理与方法。二、原理：能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既然有差别，它们的理化性质也就有所差异。因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。例如乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，但经电泳法分离后，就有5个同工酶区带。由于同工酶在不同组织、器官中的分布不同，即具有组织器官特异性。因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据，也被利用于生物分类及遗传育种等工作中。本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶五个同工酶（LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5）。血清乳酸脱氢酶的辅酶是NAD+。当它催化乳酸脱氢时，NAD+即被还原成NADH·H+。如果还有氧化型吩嗪二甲酯硫酸盐（N-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate，简称PMS）和硝基蓝四唑（氮蓝四唑nitroblue tetrazolium，简称NBT）存在，则发生如下反应： NADH·H+PMS NAD+PMS·H2 PMS·H2+NBT PMS+NBT·H2NBT·H2为蓝紫色化合物。当LDH同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后，给予NAD+、底物（乳酸）、PMS和NBT，同工酶区带即呈蓝紫色。乳酸脱氢酶在辅酶I的递氢作用下，使乳酸脱氢而生成丙酮酸。LDH分子量约14万。草酸、乙二胺四乙酸对本酶有抑制作用，所以血浆不适宜测定乳酸脱氢酶活力。此外，硼酸、汞离子、对氯汞苯甲酸以及过量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用。乳酸脱氢酶催化反应是碳水化合物代谢中无氧糖酵解的最终反应，广泛存在于人体各种组织中，按新鲜重量计算，乳酸脱氢酶活力依下列顺序降低：肾脏心肌、骨胳肌胰脾肝肺。血清中含量很低，红细胞中含量较血清约高100倍，故测定时应避免溶血。如不能及时测定，血清应及早和血块分离，避免红细胞中乳酸脱氢酶逸入血清中。乳酸脱氢酶测定的方法很多，根据酶作用的反应可分为二大类：一类利用顺向反应以乳酸为基质；另一类利用逆向反应，以丙酮酸为基质。根据测定方法不同又可分为紫外分光光度法和可见分光光度法。紫外分光光度法需用紫外分光光度计测定反应中辅酶I量的变化。可见分光光度法利用2，4二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕色。目前较多使用以乳酸为基质的方法，此法所需的氧化型辅酶I较稳定，不似以丙酮酸为基质的方法需用的还原型辅酶I很不稳定（在-20也不能长期保存）。氧化型辅酶I价格也较低。此外，乳酸钠基质液也比丙酮酸基质稳定，室温中可放1个月。近来有人利用顺向反应形成的还原型辅酶I可以还原某些染料如2，6二氯酚-吲哚酚（2，6-dichlorophenol-indophenol）、氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑（INT）建立了另外一种类型呈色反应，并以吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）或黄递酶（diapho-rase）作为还原型辅酶I和染料之间的递氢体。此法快速，操作简单，重复性较好。乳酸脱氢酶同工酶显色一般也多利用此类还原四唑蓝方法。三、器材及试剂：1器材：人血清滤纸吸管0.2ml(×1)、1ml(×2)、2ml(×1)微量注射器50l（×1）恒温水浴锅。载玻片2.5×7.5cm（×2）试管水平台；水平仪烘箱分光光度计凝胶成像系统坐标纸电泳槽；电泳仪小铁棒（2mm×15mm）、磁铁2试剂：巴比妥-HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol·L-1）：溶17.0g巴比妥钠于600ml水，加入1mol·L-1HCl溶液23.5ml，再加蒸馏水至1000ml。0.5mol·L-1乳酸钠溶液：称取5.6g乳酸钠，溶于蒸馏水并稀释至100ml。0.001mol·L-1 EDTA·Na2（乙二胺四乙酸钠盐）溶液：称取EDTA·Na2·H2O372mg，溶于蒸馏水并稀释至100ml。0.5%琼脂糖凝胶：溶50mg琼脂糖于5ml巴比妥-HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol/L），加蒸馏水5ml，待琼脂糖溶化后，再加0.001mol·L-1 EDTA·Na2溶液0.2ml，冰箱保存备用。0.80.9%琼脂糖染色胶：溶8090mg琼脂糖于5ml巴比妥- HCl缓冲液（pH8.4，0.1mol·L-1），加蒸馏水5ml，待琼脂糖溶化后，再加0.001mol/L EDTA·Na2溶液0.2ml，冰箱保存备用。显色液：现用现配。溶50mgNBT(硝基蓝四唑)于20ml蒸馏水（25ml棕色容量瓶），溶解后，加入NAD125mg及PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）12.5mg，再加蒸馏水至25ml。该溶液应避光低温保存，一周内有效。如溶液呈绿色，即失效。2%醋酸缓冲液：2ml醋酸（99.5%）加蒸馏水98ml。电泳用缓冲液（pH8.6，0.075mol·L-1）；巴比妥钠15.45g、巴比妥2.76g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。0.1mol·L-1甘氨酸溶液：称取甘氨酸7.505g，氯化钠5.85g，用蒸馏水溶解并稀释至1000ml。乳酸钠缓冲基质液(pH10.0)：在乳酸钠溶液（6570%）10ml中加入0.1mol·L-1甘氨酸溶液125ml、0.1mol·L-1氢氧化钠75ml，混和。辅酶I溶液：溶解辅酶I10mg于蒸馏水2ml中，冰箱保存，约可用6周。2，4二硝基苯肼溶液：称取2，4二硝基苯肼200mg，先溶于10mol·L-1盐酸100ml中，再以蒸馏水稀释至1000ml。0.4mol·L-1氢氧化钠。丙酮酸标准液（1mol·ml-1）：溶解丙酮酸钠11mg于100ml乳酸钠缓冲基质液中（或取丙酮酸17.6mg，溶于200ml乳酸钠基质缓冲液中），临用前配制。四、操作步骤：（一）琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶。1琼脂糖凝胶板的制备和电泳：将0.5%琼脂糖凝胶水浴加温熔化。取2ml熔化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上（载玻片放在水平台上，载玻片的大小为7.5×2.5cm）。在凝胶半凝固时，用一小铁棒在1/3处放下，待胶凝固后，用磁铁吸出小铁棒，用滤纸片仔细吸去小槽内液体，此小槽为点样槽（图18-1）用微量注射器向小槽内加入新鲜血清1520l。将凝胶板放在电泳槽内，两端各以浸有电泳缓冲液的滤纸或纱布作盐桥，点样端靠近阴极。电泳4060分钟，电压约100伏。2显色：约于电泳终止前10分钟，将0.80.9%琼脂糖染色胶在水浴中熔化。取此熔化的凝胶0.67ml与显色液0.53ml及0.5mol·L-1乳酸钠溶液0.2ml混匀，立即浇在电泳完毕的凝胶板上，37避光保温1小时，即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带。最靠近阳极端的区带是LDH1，依次为LDH2、LDH3和LDH4，LDH5则移向阴极端。3固定与干燥：将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中，2小时后取出，用一干净滤纸覆盖凝胶板上，50烘1.52小时，烘干后，取下滤纸，背景即透明。如需定量，可用凝胶成像分析系统或光密度计测定各区带。（二）LDH活力测定1标准曲线绘制见表18-1。单位定义 以标本100ml即100ml原血清在37作用15分钟产生丙酮酸分子1个微摩尔为1个单位。表18-1 血清乳酸脱氢酶比色测定法标准曲线绘制操作步骤试剂（ml）管 号012345678910丙酮酸标准液（1mol·ml-1）乳酸钠缓冲基质液蒸馏水2，4二硝基苯肼溶液1.000.301.00.050.950.301.00.100.900.301.00.150.850.301.00.200.800.301.00.250.750.301.00.300.700.301.00.350.650.301.00.400.600.301.00.450.550.301.00.500.500.301.037水浴15分钟0.4mol·L-1氢氧化钠1010101010101010101010OD值（440nm）各管含丙酮酸微摩尔数00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50混和后室温静置5分钟，用440nm，以0号管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。以各管光密度值为纵坐标，以各管含丙酮酸微摩尔数为横坐标，绘制标准曲线。附注：1草酸盐能抑制乳酸脱氢酶活力，故不能用抗凝血进行测定。2测定结果超过2500单位时，应将血清稀释后再做。3如以L-乳酸钠配制缓冲基质液时，只需用DL-乳酸钠一半量，即5ml即可。 如电压不足100V，需适当延长电泳时间。温度不得超过40。正常人血清乳酸脱氢酶各同工酶的百分比是：LDH133.4%，LDH242.8%，LDH318.5%，LDH43.9%，LDH51.4%。故靠近正极端的三条区带最明显。2LDH活力测定先将血清标本作1/5稀释（血清1份加蒸馏水4份），然后按表18-2进行操作。表18-2 血清乳酸脱氢酶比色测定法操作步骤测定管（平行做两管）对 照 管稀释血清（1/5）乳酸钠缓冲基质液蒸馏水ml0.10.5ml0.10.50.137水浴约3分钟辅酶I溶液0.1混匀，37继续保温，15分钟准2，4二硝基苯肼溶液0.50.5混匀，37水浴，15分钟0.4mol·L-1氢氧化钠5.05.0混和后室温静置5分钟，用440nm进行比色，对照管校正光密度到0点，读取测定管光密度读数，以测定管光密度平均值于标准曲线上查其相应的丙酮酸微摩尔数。五、结果与讨论：1用凝胶成像系统对LDH同工酶各组分进行定量。2计算出血清LDH总活力：绘制出标准曲线按下述公式计算LDH总活力LDH总活力=3总结出来实验中电泳分离LDH操作的关键步骤。4写出酶活力测定中的注意事项。思 考 题本实中LDH同工酶的显色方法活性染色法代表着一类电泳区带染色方法，分析该活性染色法还能在哪些酶中应用？