AFLP分子标记技术及其应用课件.ppt

AFLP,分子标记技术及其,应用,涪陵师范学院生命科学系,主讲人：江,波,AFLP,分子标记技术及其应用,?,一、什么叫,AFLP,？,?,二、,AFLP,的基本原理是什么？,?,三、,AFLP,的实验过程怎样？,?,四、,AFLP,的应用研究如何？,?,五、对,AFLP,的评价,?,生物的多样性主要包括四个层次即：遗,传多样性、物种多样性、生态系统多样,性和景观多样性。,?,而遗传多样性是其它多样性的基础，也,可以说，生物多样性归根到底就是遗传,多样性。,?,那么大家知不知道遗传多样性是如何检,测的呢？,我们都知道世界是多姿多彩的，可以说是,五彩斑斓，花样百出，无奇不有！从生物,学这个角度来看，这到底是什么原因呢？,主要是因为生物具有多样性,！？,?,（,1,）形态学标记,?,（,2,）细胞学标记,?,（,3,）生化标记,?,（,4,）分子标记,a.,多态性高；,b.,共显性遗传，在二倍体的生,物中能区分纯合与杂合状态；,c.,在基因组中频繁出现，甚至,贯穿分布于整个基因组；,d.,选择中性；,e.,容易获得；,f.,容易操作，自动化程度高；,g.,重复性好；,h.,所得数据可在实验室之间交,流和比较,我们这里讲的,AFLP,就是一种分子标记技,术。它是,Amplified,Fragment Length,Polymorphism,的简写，,叫做扩增片断长度多,态性。,分子标记的历史：,?,第一代分子标记技术,RFLP,（,Restriction Fragment,Length Polymorphism,，限制性片段长度多态性）,?,第二代分子标记技术,RAPD,（,Random Amplified,Polymorphic,DNA,，,随机扩增多态性,DNA,）,?,AFLP,（,Amplified Fragment Length Polymorphism,，,扩增片断长度多态性,）,?,事实上，还有很多分子标记技术像,SSR,、,ISSR,、,SRAP,（相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称,为第三代分子标记的,SNP,（,单核苷酸多态性,),等,AFLP,的基本原理,?,基因组,DNA,经两种限制性内切酶酶切，形成分子,量大小不等的随机限制性酶切片段，将特定的人,工合成的短的双链接头连在这些片段的两端，形,成一个带接头的特异片段，通过接头序列和,PCR,引物,3,端选择性碱基的识别，对特异性片段进行,预扩增和选择性扩增。最后只有那些两端序列能,与选择性碱基配对的限制性酶切片段才能被扩增；,最后将选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯,酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。,AFLP,的实验流程,?,模板制备,?,DNA,的提取（,SDS,法和,CTAB,法）,?,酶切,?,连接,?,PCR,扩增,(PCR AMPLIFIED),?,预扩增,(Pre-amplified),?,选择性扩增,(Elective amplified),扩增片段通常用变性聚丙烯酰胺凝,胶电泳，根据扩增片段大小范围选,择应用,4%,一,10%,的凝胶电泳。,应用放射自显影、银染、荧,光测序仪等方法显示结果，,通过,Gene-Scan,Gel-Compare,等软件进行数据分析。,?,扩增产物凝胶电泳,?,结果分析,DNA,的提取（,SDS,法和,CTAB,法）,?,SDS,是,Sodium dodecyl sulfate,的缩写称为,十二烷基磺酸钠，,?,CTAB,是,Cetyl trimethyl ammonium,bromide,的缩写十六烷基三甲基溴化氨，,?,两种都是去污剂，它们都能破坏细胞膜,使膜蛋白变性沉淀，故而使核酸释放出,来，另外，它还能保护,DNA,不受内源核,酸酶的降解。,酶切,?,为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用两个限制性内,切酶，一个用,6,个碱基识别位点的限制性内切酶,(,常用,EcoRI,、,PstI,或,SacI),，另一个用,4,个碱基识别位点的限制,性内切酶,(,常用,MseI,、,TaqI),。采用双酶切的主要原因有：,(1),多切点酶产生较小的,DNA,片段，而切数点较少的酶,能够减少扩增片段的数目，因为扩增片段主要是多切点,酶和切点数较少的酶组合产生的酶切片段，这样就可以,减少选择扩增时所需要的选择碱基数。,(2),双酶切可以进,行单链标记，从而防止形成双链造成的干扰。,(3),双酶切,可以对扩增片段数进行灵活调节。,(4),通过少数引物可产,生许多不同的引物组合，从而产生大量的不同的,AFLP,指纹。这样，经过酶切后就形成了三种类型的酶切片段，,如,EcoRI/MseI,酶切形成,EcoRI,一,EcoRI,片段、,EcoRI,一,MseI,片段、,Mse,工一,MseI,片段，由于,AFLP,技术革新成,功的关键在于,DNA,的充分酶切，所以对模板质量要求很,高，要注意避免其它,DNA,污染和抑制物质存在。,连接,?,酶切后的,DNA,片段在,T4 DNA,连接酶作用,下与两种内切酶相应的特定接头相连接，,形成带接头的特异性片段。接头为双链，,由两部分组成，一部分是核心序列，一部,分是酶特定序列,(,能与酶切片段粘端互补,),，,通常在酶特定序列中变换了一个内切酶识,别位点的碱基，保证了连接片段不能再被,酶切。只有遵循“引物扩增原则”设计的,接头才能得到满意的扩增结果。,PCR,扩增,(PCR AMPLIFIED),?,应用与接头相识别的引物进行扩增。,AFLP,引物由三部,分组成：（,1,）,5,端的与人工接头序列互补的核心序列,(core sequence),（,2,）限制性内切酶特定识别序列,(enzyme-specific sequence),（,3,）,3,端的带有选择性碱基,的粘性末端,(selective extension),，其中,AFLP,接头的设计,(,包括核心序列和酶特定序列,),是关键之处，常用的多为,EcoRI,和,MseI,接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱,基序列是引物的结合位点，合成的寡核苷酸接头经过,94,变性，,37,退火，,4,保存备用；理论上每增加一,个选择性碱基，将只扩增限制性片段的,1/4,，而在两个,引物上都有三个选择性碱基的情况下，则仅获得,1/4096,的片段；也就是说，只有那些两端序列能与选择碱基配,对的限制酶切片段被扩增。所以选择性碱基是选择用于,扩增的特定的限制性片段的一种精确而有效的方法；,?,预扩增,(Pre-amplified),?,扩增所用引物,3,端有一个选择碱基，通过,预扩增对扩增模板进行初步筛选，一方面,可以避免直接扩增造成的指纹带型背景拖,尾现象，另一方面可以避免直接扩增由引,物,3,端,3,个选择碱基误配形成的扩增产物。,?,选择性扩增,(Elective amplified),?,预扩增产物经稀释后进行选择性扩增，使,所需模板量不受限制。所用引物,3,端有,3,个,选择碱基的延伸，通过,3,个选择碱基的变换,获得丰富的,DNA,片段。,AFLP,技术的改良,?,内切酶的应用,?,有多种内切酶组合如,EcoRI,、,PstI,、,SacI,、,HindIII,或,Apal,与,MseI,、,TaqI,用于,AFLP,技术,?,只应用一种内切酶制备模板（单酶切）,?,也有应用三种内切酶的报道（三酶切）,TE-AFLP,?,引物的标记及结果显示,?,引物标记已从同位素标记发展到目前的荧光标记，荧光标记,减少了同位素对人体的损害，同时使结果分析更加便利准确，,但费用仍然很高，单酶切,AFLP,法的引物不需要标记，只需通,过琼脂糖凝胶电泳、紫外透射仪观察结果，省时、方便，但,溴化乙锭对人体有危害。现有一种银染法可以降低成本又对,人体无害，但操作相对复杂繁琐又费时。,?,其它类型,?,AFLP,技术是基于对基因组,DNA,的分析而创建的，目前已有,cDNA-AFLP,，还有甲基化敏感,-AFLP,。,EcoR I,Mse I,（限制性内切酶）,EcoR I,接头,Mse I,接头,EcoR I,引物,+A,Mse I,引物,+C,（预扩增）,EcoR I,引物,+AAC,Mse I,引物,+CAA,（选择扩增）,（连接）,（电泳检测）,AFLP,的应用研究,?,AFLP,技术在植物研究上的应用,?,基因定位及构建遗传图谱,?,遗传多样性分析和种质资源鉴定,?,辅助育种,?,研究基因表达与调控,?,居群的遗传结构与保护生物学研究,?,其它方面的应用,?,AFLP,结合,BSA(,分群分析法，,Bulk segregate,analysis,),可进行基因的快速定位；,Ballvora,利,用,AFLP,技术结合,BSA,法精确定位了马铃薯,的根包囊线虫抗病基因,Grol,；,AFLP,技术能,找出因基因枪法或完整细胞电穿孔而产生的,转基因大米中发生的隐藏的基因改变；对于,构建遗传图谱，,AFLP,被认为是迄今最有效,的分子标记技术；近几年来，利用,AFLP,技,术已对桉树、杨树、松树、桃树进行了遗传,图谱的构建并取得了长足的进展。,AFLP,技术在植物基因定位,及构建遗传图谱上的应用,AFLP,技术在植物遗传多样性,分析和种质资源鉴定上的应用,?,种质资源收集的遗传多样性可通过谱系记录与,DNA,指纹,分析两条途径相结合，其目的是对种质资源进行分类、,描述杂合的类群与杂合式样、追索育种的历史；,AFLP,在鉴定与评估种质资源方面有广泛的应用前景；有人进,行了花生多态标记的,AFLP,鉴定；有人用,AFLP,评估了太,平洋西北小麦品种的遗传多样性；还有人用了,6,个,AFLP,引物组合得到,359,个,AFLP,扩增带，对,24,个向日葵优良品,系的遗传多样性进行了分析。另周志勇等人采用双酶切,的方法，将,AFLP,技术应用于人参、西洋参基因组指纹,图谱，发现二者在遗传上有较近的亲缘关系，但引种到,我国吉林的西洋参与西洋参基因组,DNA,相比有一定变异，,证明了,AFLP,分子标记技术有望成为一种独立的、确实,可行的手段，用于人参、西洋参等药用植物品种的鉴别。,AFLP,技术在植物辅助育种研究上的应用,?,在指纹图谱技术出现以前，基因图谱只能依靠植物的表,现型和同工酶分析来建立,DNA,指纹图谱，特别是,AFLP,技术的出现，使标志的数量大大增加，进而使分辨率大,大提高；特定农业性状与标志连锁关系的建立在育种上,有重大的经济价值，使得定向育种成为可能，不仅减少,了育种的工作量，而且还使时间缩短，使人们能在植物,生长早期就预知它的某些性状并加以筛选；,Jonathan,等,人通过,AFLP,标志研究番茄，发现许多,DNA,标志与番茄,抗叶霉病菌的基因相联系；同样，,Christiane Gebhardts,小组发现,29,条,AFLP,标志与马铃薯抗晚疫病菌的,R1,基因,有关，,2,条与抗孢囊线虫的基因有关；用相同的方法,Matthews,等也发现与白杨抗叶锈病相关的标志；这种将,传统育种与现代分子生物学结合的分子标记协助育种已,被大量的采用。,AFLP,技术在植物基因表,达与调控研究上的应用,?,Bachem,等人采用,AFLP,技术检测了马铃薯,块茎发育过程中基因表达情况，他们利,用,3,个引物组合,进行块茎发育不同时期的,AFLP,分析，得到了块茎特异转录的片段,TDFS,，,2,个,TDFS,片段与关键基因,LOX,高,度同源，且二者在块茎的不同时期表达,的量不一样；表明了,AFLP,是研究基因表,达非常有效的方法，可同时比较植物不,同时期以及分离某些重要基因。,AFLP,技术在植物居群的遗传结构,与保护生物学研究研究上的应用,Travis,等,1996,年第一次将,AFLP,产生的,220,个多态标记用于评估,一种临界于濒危的黄芪属,(,Astragalus,),植物（,Astragalus,cremnophylax,var.cremnophylax,）的,3,个已知居群的居群内与居,群间的多态信息含量和遗传变异的分配，他们还用,AMOVA,分,析了居群间的分化；这些结果指出在居群内存在空间上分离的,组，与,UPGMA,聚类和主成分分析的结果一致；提出了保护这,个物种的若干建议；,Krauss,和,Peakell,用,AFLP,对,Persooniamollis,的天然居群作了分析；,Winfield,1988,年研究了英国,Sevem,地区黑,杨亚种,Populasnigra,subsp.Betulifolia,的遗传多样性；,Breyne,等,1997,年将,Arabidopsis,thaliana,作为模式物种，用,AFLP,技术评估,了基因组的多样性；他们认为,AFLP,测十分相近的基因型之间的,细微差异足够灵敏，非常适合于评估居群内与居群间的多样性,水平和描述种下水平的遗传关系；他们也用,AFLP,测定天然居群,和热带树种的遗传变异。,其它方面的应用,?,AFLP,技术除可以用于植物方面外还可以用于动、微生物、,寄生虫、昆虫、人群等方面。吴丰春等应用,AFLP,技术采用,单酶切对小鼠进行了遗传检测的研究，为小鼠从,DNA,上的,遗传检测提供了一种新的技术手段；,AFLP,技术在微生物学,领域的应用也相当广泛，在微生物分类、基因标定、亲缘关,系及遗传多样性研究都有不俗的表现，特别是微生物的鉴定,和品系分析方面更是成绩可佳。在流行病检测中,AFLP,标记,已成为微生物病原体诊断的理想技术。在肿瘤发病机制的研,究中，肿瘤易感基因的检测是首要任务，而,AFLP,标记为肿,瘤基因组的检测带来了一种新的方法。是一种较为理想的技,术。,Fukuda T,等用,cDNA-AFLP,法对大鼠高低转移性骨肉瘤,基因组进行对比检测，得到,43,条差异片段，通过筛选，克隆,出与大鼠骨肉瘤转移有关的,4,种差异表达基因；,Majima S,等,应用同样的方法克隆出与肾癌发生相关的一种新基因,Niban,；,Yamamoto F,应用甲基化敏感,-AFLP,技术检测了乳腺,癌的基因变化。这些都会对以后研究肿瘤发病机制发挥重要,作用。,五、对,AFLP,的评价,?,AFLP,技术特点,?,（,1,）所需,DNA,量少，扩增效率高，多态性强，易于,分辨。,?,（,2,）,AFLP,标记结果稳定可靠，重复性强，不受基,因组来源和复杂度的影响，使不同时间、不同实验室,的结果可以进行比较，有利于进行回顾性研究，并促,进信息与资料的交流，达到资源共享。,?,（,3,）,AFLP,标记呈典型的孟德尔遗传，可作为物理图,谱和遗传图谱的联系桥梁，用于构建基因组高密度连,锁图谱。,?,（,4,）图谱构建聚类显著，定位专一。,?,（,5,）,AFLP,对模板浓度不敏感，允许一定强度的共扩,增，样本,DNA,量相差,1000,倍仍可获得相同的结果。,作为,DNA,指纹技术的评价,?,众多研究者对,RFLP,及,SSR,RAPD,AFLP,四种分子标记,技术进行了比较分析，综合考虑遗传稳定性和标记系统,机制,(,速度、费用、可靠性,),，提出了标记指数,MI(Marker,index),，,MI,是变异指数,DI(Diversity index),和有效复合,比,EMR(Effective multiplex ratio),两者的综合反应。,DI,是,指信息含量即期望异质性,(Expected Heterozygosity),；,EMR,是指单位实验里能同时检测到的位点数，,MI,实际,上还包含了鉴定亲缘关系的有效性这一层意思。应用这,一评价体系，得出,AFLP,具有最高的,EMR,，,SSR,具有最,高的,DI,，这一结论已在对菜豆及西北欧栽培马铃薯的研,究中得到相互验证。同时还发现，在种间水平上，,RFLP,、,SSR,、,AFLP,具有很高的相关性，然而,RAPD,与,三者相关性低。如果是在种内水平上，则所有标记系统,相关性均低，,1995,年,7,月,30,日召开的美国园艺学会,(ASHS),第,92,届年会上，与会专家一致认为四大标记系统,综合效用大小应该是,AFLP SSR RAPDRFLP,。,存在的问题极其对策,?,AFLP,技术虽然是对生物基因组进行分析的一种较为,理想的方法，但任何分子标记都有其优缺点，,AFLP,标记的不足之处在于步骤繁琐、费时、所需实验试剂,及设备费用仍较高，操作技术难度大等，如,AFLP,技,术和,DNA,纯度要求很高，需要高质量、高纯度的,DNA,，,由于其灵敏度高，微量的,DNA,污染可以导致很大的偏,差等；但,AFLP,标记无法比拟的优点,使其得到了快速,的推广和应用。用,AFLP,标记进行研究的文献比率呈,逐年上升趋势。随着,AFLP,操作步骤的简单化、规范,化和自动化，,AFLP,分析的效率会进一步提高，应用,范围会不断扩大，,AFLP,标记将成为生物学工作者手,中强有力的研究工具。,谢谢大家！,