哮喘研究从基础到临床课件.ppt

哮喘研究从基础到临床Scientific research on asthma:from bench to bedside,浙江大学附属二院呼吸科浙江大学呼吸疾病研究所 沈华浩,哮喘最新定义：支气管哮喘(简称哮喘)是一种以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症。这种炎症使易感者产生气道高反应性，表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）清晨发作、加剧，常伴有广泛多变的可逆性气流受限，多数患者可自行或经治疗后缓解。,哮喘研究的动物模型 Experimental models for asthma,应用动物模型的价值建立实验动物模型的目的是更好地解释人类疾病发病过程。通过动物模型，我们可以探讨许多难以直接从临床得到的疾病发病机理。尽管各种动物模型在体现人类疾病上还存在一定的缺陷，但不可否认的是通过动物模型所得到的信息，使得我们对人类疾病过程有了更透彻清晰的认识。,人类哮喘的特征,气道慢性炎症：大量炎性细胞 T 淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润等，它们释放出LTs、PGs、PAF等炎性介质，引起微小血管渗漏、支气管黏膜水肿、腺体分泌增加、粘液栓形成等病理改变，气道高反应性（AHR）：气道对特异和非特异刺激的高反应性，如组织胺，乙酰甲胆碱。气道重建：上皮脱落、上皮下基底膜胶原沉积、平滑肌肥大增殖、粘膜水肿、杯状细胞及粘液腺增生分泌亢进，气道周血管扩张，新生血管形成。,临床研究哮喘受限制,一、肺组织标本获取不易，具有一定危险性。并且仅能反映疾病发展中的某一点，不能全程反映疾病过程。二、BALF的获取更需疾病允许，尤其哮喘发作时难以获取，不易将肺的结构（病理）和功能（病理生理）结合起来。三、要明确参与LAR过程的抗体类型很不容易，因为我们不可能将某个特异抗原免疫病人而使其产生相应抗体或为其输注抗原特异性抗体。四、不能冒着哮喘发作的危险来探索引起哮喘发作的抗原。,研究哮喘的动物1 生来具有反复发作性喘息的动物：猫、马。2 抗原激发前即具有AHR的动物：狗、啮齿类动物。3 仅在抗原激发后方具有可逆性气流阻塞和/或AHR的动物：兔、羊、豚鼠、大鼠、小鼠。,生来具有反复发作性喘息的动物,马亦存在自发性反复发作的气流阻塞。这是因为致敏状态的马经常暴露于含有真菌孢子的干草的缘故。相同点：哮喘类型 与人类哮喘相似的特征职业性哮喘 暴露于抗原时症状明显 脱离抗原环境、症状缓解 AHR可因脱离抗原而降低变应性哮喘 可逆性反复发作的气流阻塞 发作后可缓解 具有明确的过敏原,抗原激发诱导可逆性气流阻塞和气道高反应性的动物,兔 羊 豚鼠 大鼠 小鼠,激发抗原的选择,1.Protein antigen e.g.OVA,Der p,Bet V2.House dust mite(HDM)3.Fungi e.g.Aspergillus fumigatus(extract or connidia)4.Parasites e.g.Schistosoma mansoni5.Worm e.g.Nippostrongylus brasiliensis6.Chemical compounds e.g.toluenediisocyanate,激发抗原的选择,The allergen source should reflect the human situation:1.HDM,pollen and fungi are natural allergens2.inhalation is the natural exposition route 3.extracts or pollen starch granula are better than purified protein,but,high degree of variance,豚鼠曾经广泛应用于哮喘研究，直到1985年才首次在豚鼠哮喘模型上描述LAR时相，之后许多学者应用豚鼠研究了LAR。,Brattard（1985）OVA+Al(OH)2致敏豚鼠(IP)，使动物机体产生OVA特异性IgE和IgG.在麻醉状态下，气管内滴注OVA微粒抗原致敏,6小时后可诱发出LAR，48小时后消失。该模型中，IAR时相产生的肺阻力大于24小时后的LAR。对未致敏豚鼠或产生IgG而非IgE的致敏豚鼠进行攻击均不能诱发出LARs，组织学表现：以嗜酸粒细胞浸润为特征的局限性细支气管炎，平滑肌收缩、粘膜下水肿和气道粘液形成在激发前/后应用激素可抑制LAR时相反应，但并不能阻断炎症细胞的募集。,建立豚鼠哮喘模型有多种不同的方法（抗原种类、致敏方式等）、不同的麻醉方法和肺功能测定方法；结果表示也有不同的方法（LAR出现的时间、LAR产生的次数、LAR强度）。这说明即使在同一品系动物，应用不同的方法可引起不同程度的气流阻塞。重要的是在不同的背后存在相同之处。如在三组实验中有两组证明了在引起LARs方面抗原特异性IgE比抗原特异性IgG更为重要。此外，所用实验均说明了Eos的肺内募集与LAR存在相关性。,应用OVA主动免疫致敏或应用大鼠杂交瘤产生的 抗二硝基酚IgE被动免疫致敏。气管内给予特异性抗原。24hr后，OVA致敏组BAL中多形核细胞明显高于对照组，被动免疫致敏组（IgE致敏组）应用抗原雾化攻击12hr后BAL中的多形核细胞明显上升，24hr恢复正常。对IgE致敏组进行组织病理学检查显示，攻击2h后可见肺泡和间质水肿，伴有局限性细支气管周围多形核细胞浸润，炎症在24hr后消失。另外可见间质内单核/巨噬细胞浸润。无论是主动免疫致敏还是被动免疫致敏大鼠，均能建立起抗原特异性IgE依赖的气道炎症。,小鼠小鼠模型已成为研究抗原诱导的气道反应性的一个重要的模型，因为对小鼠免疫系统认识广泛全面，可以用来研究T细胞在AHR发生发展中的作用。小鼠不仅可用常规方法激发，也可采用其他更简易的方法。如观察静脉给予MCH致气道收缩所需浓度。,小鼠3 正常或抗原致敏的小鼠气道可用来研究电刺激后神经元介质的释放。如对某一品系的小鼠反复抗原暴露可使气道对神经刺激的反应增强，表现为达到50最大收缩（ES50）所需的电刺激频率明显降低，其原因是反复抗原刺激后神经元释放Ach能力增强。,小鼠最初的小动物模型之一采用了BALB/c小鼠,动物经皮给予 picryl chloride 致敏，后滴鼻给予同一致敏原激发，于激发后24至48小时可见支气管周围及血管周围巨噬细胞及淋巴细胞积聚，同时伴肺阻力增加，但无动态顺应性改变。,小鼠A/J小鼠以绵羊血红细胞致敏激发可致AHR及明显的肺Eos炎症，而使用抗CD4单克隆抗体阻断CD4+T细胞后AHR及肺Eos炎症均被抑制，可见该模型中气道功能的改变依赖 CD4T细胞，而Eos是该反应的效应细胞。,有两种方法证实此模型存在气道功能的改变。1、采用整体体积描记法：经静脉给予浓度依次增高的MCH后发现气流传导（airway conductance）改变，致敏组较非致敏组对MCH的反应性明显增高。2、采用体外测定法：离体气道平滑肌给予一定量的电流刺激，随着刺激频率的增加气道收缩增强，结果致敏组小鼠的ES50较非致敏小鼠明显降低，其机理可能是电流刺激后致敏小鼠气道副交感神经末梢释放ACH较非致敏小鼠多，同时伴M2毒蕈碱受体功能丧失。,急性哮喘模型,Protocol Sensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)1st 2nd 1st 2nd 3rd Days 0 14 24 25 26 28 Analysis(Airways Inflammation)(Lung histology)(Th1/Th2 responses),Advantages of an acute allergic mouse model,Similar to humans-Airway hyperresponsivenss-Eosinophylia-Increased IgE-Goblet cell hyperplasia/metaplasia-Mucus hypersecretion-Mucosal Edema,Advantages of an acute allergic mouse model,Useful for basic research:Role of eosinophils and CD4+T-lymphocytes Adhesion and chemotactic molecules and cell recruitment Test conventional pharmacological agents Transgenic and gene-targeted mouse,BALB/c和 C57BL/6J（B6）小鼠.近年来随着分子生物学的发展，通过转基因或基因敲除技术，已培育出数十种新的小鼠品系:IL-5转基因:IL-5+/+，如NJ 1638 和 NJ 1720）.IL-5基因敲除（IL-5-/-）品系.IL-4-/-品系，IFN-a-/-品系，CD4-/-、CD8-/-、T细胞-/-，Eotaxin+/+、Eotaxin-/-，IL-13-/-，等。,特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较 细胞/细胞因子 气道上皮 气道粘液 BAL AHR 缺陷 病理 分泌亢进 嗜酸性粒细胞（Mch）B cells+T cells(ab,gd)alphabeta+T cells gammadelta+T cells+/-?CD4+cells CD8+cells+NK-T cells ND ND+NDEosinophils+/-+/-野生小鼠+,特殊类型细胞和细胞因子基因敲小鼠抗原致敏和激发后气道炎症反应比较 细胞/细胞因子 气道上皮 气道粘液 BAL AHR 缺陷 病理 分泌亢进 嗜酸性粒细胞（Mch）(IL-5-/-)+/-+/-IL-4-/-+/-+IL-13-/-+/-+/-IFN-r-/-+野生小鼠+,0 3 6 12 25 50 Methacholine Dose(g/kg),Effects of Huangqi and DXM on airway responsiveness in OVA-sensitized mice.Airway responsiveness was measured at 48h following last OVA challenge.A The Mean dose response curves to nebulized methacholine(Mch).Airway reactivity(Penh,y-axis)in response to increasing doses of nebulized Mch(x-axis)was assessed by whole-body plethysmography.Data are expredded as the means SEM(n=8-10).*p 0.05 compared with saline/saline mice.p 0.05 compared with saline-treated OVA challenged mice.,Disadvantages of an acute allergic mouse model,-No asthma spontaneously-No genetic and environmental factors-Airways insensitive for histamine-Hardly airway remodeling-No eosinophils in airways under basal conditions-Hardly airway remodeling and not a chronic disease,慢性哮喘模型/气道重构模型,Protocol Sensitization(i.p.OVA)Challenge(1%OVA)Analysis(Airways Inflammation)(Lung histology)(Th1/Th2 responses),Advantages of a chronic allergic mouse model,-Sustained AHR-Sustained inflammation-Smooth muscle&goblet cell hyperplasia-Airway remodeling,Disadvantages of a chronic allergic mouse model,-Time consuming-Expensive-Need more test-compound-AHR not always related to remodeling,Conclusions,-The allergic models that should be used in different experiments are determined by the distinct research aims.-In general,a chronic model is in favor of an acutemodel since it mimics better the situation in humans,哮喘动物模型的局限性任何疾病的动物模型均有局限性。1、不同种系之间存在的差别限制了动物模型结果在人身上的应用。比如人与动物的气道神经支配就存在显著差别，气道平滑肌中肾上腺素能神经支配很少。2、所有品系均有其局限性。如，研究肺心病易在大动物上进行，另一方面，详细描述气道病理又宜在小动物身上进行，研究影响气道反应性的免疫因子采用小鼠较为合适。总之，没有一种模型可解决碰到的所有问题。因此动物实验工作者在模拟人类疾病过程的时候应考虑到他们实验的局限性。,哮喘动物模型的局限性3、虽然哮喘的病理过程大致可在动物模型上得以体现，但没有一个可完全体现它的特点。如家兔模型中描写到速发和迟发反应，但没提到基底膜增厚和平滑肌增生。还有，没有一个LARs模型能表现在未受激发底情况下出现自发性气道阻塞和哮喘样综合症。马可以引起马喘息病，在去除诱发的环境因素后可恢复到发作前水平。但人的哮喘气道高反应性的存在往往要更长一些。4、在绝大多数的LARs模型中气道高反应性的存在往往时间较短，增高幅度也不大。犬模型有持续存在的AHR，但也没提到自然发生的气道阻塞。因此，没有一个模型能完全模仿人的哮喘。,小结-哮喘实验动物模型研究的应用一、动物模型局限性的存在不表示它不应被采用，只是提醒我们在运用动物模型时要考虑到它的局限性。应用动物模型研究人类疾病有它不可否认的作用。二、新的哮喘模型有使用基因突变模型来研究调节气道反应性的遗传和生化机制。利用动物模型研究气道反应性发生的正常或者异常的过程可以进一步探讨出生后环境因素对AHR的影响。,小结-哮喘实验动物模型研究的应用三、为更好地研究哮喘的免疫病理，一系列的动物模型已被采用。许多动物（如：家兔、绵羊、豚鼠、大鼠、猴子、狗、小鼠等）被某一抗原致敏激发后出现肺功能改变（IARs、LARs、气道反应性增加）。四、虽然动物模型模仿了人类哮喘的很多特点，但没有一个模型能完全具有人类哮喘的特征。但在很多方面还是可用动物模型进行研究，包括抗原暴露后的病理变化，各种免疫球蛋白、炎性细胞及介质对气道功能的影响。今后将开展包括AHR的遗传学研究、正常或异常气道功能发生过程等在内的诸多方面的研究。,哮喘的临床研究一、人类哮喘自然病程下的临床研究 二、过敏原激发实验以模拟人类哮喘发病的病理生理过程,一、人类哮喘自然病程下的临床研究哮喘自然史研究（流行病学调查）,Risk factors probably associated with infant wheezing,Male genderLow birth weight.Environmental tobacco smoke.Virus infections.,Incident Physician Diagnosed Asthma in Norrbotten over 3 Years,1996-99(n=2,100),At RiskRelative Risk MultivariateMale Sex 51%1.1 0.73-1.8 n.s.Family History 24%2.8 1.8-4.46 3.3 2.7-3.9Birth weight(2.5kg)4.2%1.4 0.52-3.8 n.s.Cat at home ever 38%0.49 0.28-0.83 0.55-0.2-1.3*Type I allergy 20.6%4.9 2.9-8.4 5.5 4.9-6.1 Cat 13.4%7.4 4.3-12-Dog 8.7%4.1 2.1-7.69-,*Cat was a significant negative factor if Type I allergy was removed from the analysis.Perzanowski,M.,et al.AJRCCM 2002.,Reduced prevalence of hay fever,atopy and asthma among farmers children.,In Switzerland:Braun-Fahrlnder et al Clin Exp Allergy 1999In Germany:von Ehrenstein et al,Clin Exp Allergy 2000In Austria:Riedler et al,Clin Exp Allergy 2000In Finnland:Kilpelainen et al Clin Exp Allergy 2000In Canada:Ernst et al,Am J Resp Crit Care Med 2000In Australia:Downs et al,Clin Exp Allergy 2001European-wide:Leynaert et al,Am J Respir Crit Care Med 2001,Results of a home based environmental intervention among urban children with asthma.,Controlled trial of allergen specific avoidance for one year.Plus one year extension.937 children age 5-11 in seven US citiesIntervention ResultsFewer symptom days first and second years(p0.001).Significant decline in dust mite and cockroach allergen(p0.001).Reductions in dust mite and cockroach allergens on bedroom floor significantly associated with reduced complications of asthma.Morgan et al 04 New Eng J Med 351:1068,（一）最大呼气流量（PEF）监测（二）支气管扩张剂试验（三）气道激发试验（四）无创性气道炎症指标监测（五）变应性指标监测：包括血清总IgE和特异性IgE测定，过敏原皮肤试验，过敏原吸入激发试验（六）支气管粘膜活检,2.哮喘病情评估,1、血液：嗜酸性粒细胞（Eos）计数、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）、嗜酸性粒细胞过氧化酶（EPO）、可溶性白细胞介素-2受体测定；2、尿：嗜酸性粒细胞过氧化酶、9,11-前列腺素F2、白细胞三烯E4；3、呼出气体分析：一氧化氮、一氧化碳、碳氢化合物；4、呼吸冷凝物：过氧化氢、白三烯代谢物、硝基酪氨酸5、诱导痰：细胞分类尤其Eos绝对计数、可溶性介质（ECP，半胱氨酰白三烯等）。,无创性气道炎症指标监测,过敏原激发实验以模拟人类哮喘发病的病理生理过程速发相哮喘反应：特异性支气管激发试验中吸入变应原后数分钟至数十分钟出现的支气管收缩反应。可作为研究哮喘急性发作的模型。迟发相哮喘反应：特异性支气管激发试验中吸入变应原后数小时至24小时出现的与IgE有关的哮喘反应。可作为研究哮喘病气道慢性炎症的模型。,Allergen-induced increases in IL-5 receptora-subunit expression on bone marrowderived CD34+cells from asthmatic subjects,The dual responders,but not the isolated early responders,developed a significant increase in methacholine airway responsiveness 24 h after allergen challenge.,Allergen-induced increases in IL-5 receptora-subunit expression on bone marrowderived CD34+cells from asthmatic subjectsIn DR,but not IER asthmatics,a significant increase in the percent of CD34+cells expressing IL-5Ra was detected when pre-allergen bone marrow samples were compared with 24 h post-allergen aspirates.These data suggest that increased expression of IL-5Ra on CD34+cells favors eosinophilopoiesis and may thus contribute to the subsequent development of blood and tissue eosinophilia,a hallmark of allergic inflammation.Sehmi et al.JCI,1997.,Allergen-induced fluctuation in CCR 3 expression on bone marrow CD34+cells from asthmatic subjectsThe number of bone marrow CD34+CCR3+cells is significantly increased in DR asthmatics who characteristically develop a late-bronchoconstrictor response,sputum and blood eosinophilia and increased methacholine airway responsiveness 24hr after postallergen inhalation.However,a significantly attenuation in the numbers of CD34+CCR3+cells was observed in ER asthmatics who do not develop a blood eosinophilia and airway responsiveness after postallergen inhalation.Sehmi et al.Immunology,2003.,“IL-5 Story”根据基础研究的结果可以提出假说和指导临床实践。但是动物模型和人体实验的结果并不总是一致的！,“IL-5 Story”“Treatment of OVA-challenged animals with anti-IL-5 antibody during the sensitization protocol completely abolished the infiltration of eosinophils into the lung tissue and prevented the development of AHR”Hamelmann E.et al.:Am J Respir Crit Care Med.1997 and 1999“Monoclonal antibodies directed against IL-5 have been used in at least four studies involving patients with asthma.Those preliminary studies have shown clear reductions in both blood and sputum eosinophils but no significant changes in physiological parameters of AHR,the late asthmatic reaction or in lung function or symptoms”Leckie M.J.:Am J Respir Med.2003,“IL-5 story”-可能的原因,analysis,sensitization,challenge,aerosol,i.p./s.c.,analysis,allergen challenge,treatment,human,mouse,treatment,aerosol,years,weaks,chronic inflammation,Hamelmann et al.Am J Respir Crit Care Med.1999,对第1层和第2层病人的试验设计方案,舒利迭 50/100or 氟替卡松 100,8-周 哮喘控制评估,4-周 哮喘控制评估,第一阶段,舒利迭50/250or氟替卡松250,舒利迭50/500or氟替卡松500,Step 1,Step 2,Step 3,GOAL Study,回访次数123456789周-404122436485256,Run-in,Budesonide pMDI spacer 600 g bid,Budesonide Turbuhaler 200 g bid,Placebo,Terbutaline pMDI spacer 375 g bid,Budesonide pMDI spacer 600 g bid,Run-in No 2,Two years,Third year,Early vs delayed intervention,Haahtela et al.NEJM 1994,研究方法,筛选,布地奈德/福莫特罗都保（160/4.5g/吸）x 2吸一日二次,布地奈德都保（200g/吸）x 2吸，一日二次福莫特罗都保（4.5g/吸）x 2吸，一日二次,随机化,周数-2024681012就诊12345,今后的若干研究方向 1.哮喘遗传病学研究：哮喘和/或特应症基因的确定。2.阐明神经和内分泌因素在哮喘发病中的作用。3.哮喘病慢性化的机制：持续性慢性气道炎症;气道重 构；其它因素？4.发展和筛选反映哮喘气道炎症及其严重度的无创方法和可靠指标。5.发展新的抗炎药物，如chemokine receptor antagonist；neurotrophin-and receptor antagonists peptidase inhibitors antisense oligos against STATs；C3a and C5a receptor antagonists。6.长期吸入ICS和LABA的副作用和安全性。,