目的基因的克隆PCR法扩增目的基因片断课件.ppt

目的基因的克隆 PCR法扩增目的基因片断,PCR(Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应,模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程,DNA的结构（1）,三磷酸核糖核苷NTP,三磷酸脱氧核糖核苷dNTP,三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP,DNA的结构（2）,A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶,五种碱基,A-T C-G,DNA的结构（3）,氢键维持了DNA的双螺旋结构,DNA的复制（1）,3-OH进攻5-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5-3,DNA的复制（2）,DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA,DNA的复制（3）,DNA的复制 和 体外的模拟,模板（母链）细胞内源 外源加入打开双链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环退火,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR整个过程,讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度,为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板防止非特异性的引物退火延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶,常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 0C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 0C左右。,讨论2：影响PCR质量的一些因素,模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。酶：纯度、可信度，碱基错配率1/10000。,讨论3：PCR的应用,从蓝藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶),清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品,基因库检索 SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白,讨论3：PCR的应用,检测粉末样品是否含有炭疽杆菌,炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。,有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR,讨论3：PCR的应用,基因测序,基因组计划首要任务就是测序Sanger双脱氧法,ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光,讨论3：PCR的应用,基因测序,实验步骤：,1.取一个干净PCR专用小管2.往PCR管里面加入各种试剂3.设定好机器各种参数4.开始PCR5.电泳检测PCR结果,无菌去离子水 34ul10X PCR缓冲液 5uldNTP混合液 4ulMg+溶液 3ul引物1 1ul引物2 1ul模板基因组DNA 1ulrTag聚合酶 1ul,