植物生物化学—酶.ppt

第 四 章 酶,第一节通论,一、酶是生物催化剂,酶（enzyme）是由活细胞产生的，能在体内和体外起同样催化作用的一类具有活性中心和特殊构象的生物大分子。目前将生物催化剂分为两类：酶（enzyme）体内代谢主要催化剂核酶（ribozyme）核酸底物,二、酶的催化特性,酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,1.催化效率高,酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。1mol H2O2酶 能催化 5106mol H2O2的分解 1mol Fe 3+只能催化610-4mol H2O2的分解酶的催化不需要较高的反应温度。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的 活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有 效地降低反应的活化能。,活化能,反应物（初态）活化分子（活化态）碰撞产物活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。与反应速度成反比。加快反应速度的途径：反应物加能增加活化分子 催化剂，改变反应环境降低活化能,酶促反应活化能的改变,2H2O2 2H2O+O2,2.酶的催化活性易受环境变化影响,酶的化学本质蛋白质酶反应条件温和：植物固氮酶27C，中性pH；工业合成氨500 C，几百大气压,3.酶的催化活性可被调节控制,酶的催化活性受酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等多种因素的调控。如乳糖合成酶:（正常：催化亚基）UDP 半乳糖+N-乙酰葡萄糖胺 UDP+N-乙酰乳糖胺（合成糖蛋白）（妊娠：催化+调节亚基）UDP 半乳糖+D-葡萄糖 UDP+乳糖,4.酶的催化作用具高度专一性,酶的特异性（specificity）一种酶仅作用于一种或一类底物（Substrate，被酶作用的物质即反应物），或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性。,根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下3种类型：,绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物。脲酶相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。二肽酶立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。L-精氨酸酶,族专一性（基团专一性，group specificity）,半缩醛羟基,键专一性,D-，L-立体异构专一性,L-精氨酸酶,几何异构专一性,延胡索酸,苹果酸,酶催化专一性的几种假说,(1)锁钥学说（lock and key model,1894，Emil Fisher）,酶与底物结构互补,(2)三点附着学说（A.Ogster）,立体专一性,(3)诱导契合学说（induced-fit theory,1958,Koshland）,己糖激酶与葡萄糖结合构象发生变化,第二节酶的分类和命名,一、酶的命名,自然界中酶的种类很多（4000多种），许多酶是在其底物英文名称的后面加“ase”,如脲酶：urease,lipase,protease 等，有些则不同如；胰蛋白酶：trypsin,胰凝乳蛋白酶:chymotrypsin 等，缺乏系统性和科学性，为了研究和使用的方便，1961年国际生物化学学会酶学委员会在对自然界中存在的酶进行了广泛研究的基础上，对每一种酶都给出了一个习惯名称和系统名称。,1习惯命名法（recommended name）,根据催化的底物命名：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶根据催化反应的性质命名：转氨酶、脱氢酶、脱羧酶以催化的底物和性质命名：乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶，以酶的来源或其它特征命名：碱性磷酸酶、胃蛋白酶,2国际系统名称（systematic name）,习惯名称系统名称：标明底物，催化反应的性质 两底物反应，中间用冒号，水可略去 6-磷酸葡萄糖异构酶 谷丙转氨酶：L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶草酸氧化酶：草酸：氧氧化酶乙酰辅酶A水解酶,二、酶的国际系统分类法,1分类原则 6大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类 分类编号：EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC l.1.1.1 EC(Enzyme Commision),EC号的第一个数字 1.oxidoreductase 氧化还原酶类 2.transferase 转移酶类 3.hydrolase 水解酶类 4.lyase 裂合酶类 5.isomerase 异构酶类 6.ligase/synthetase 连接酶类,2六大类酶的特征,氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂合酶,异构酶,连接酶,（1）氧化还原酶类（oxido-reductases）催化氧化还原反应的酶，包括氧化酶类、脱氢酶类、过氧化氢酶、过氧化物酶等。,乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27，L-乳酸：NAD+氧化还原酶）,（2）转移酶类（transferases）,谷丙转氨酶（GPT）（EC 2.6.1.2，L-丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶）,（3）水解酶类（hydrolases）,磷酸二酯酶（EC3.1.4.1，正磷酸二酯磷酸水解酶）,（4）裂合酶类（lyases）,醛羧酶（EC4.1.2.7，酮糖-1-磷酸醛裂合酶）,（5）异构酶类（isomerase）,（6）连接酶类（ligase，合成酶类syntheses）,三、酶的组成分类,简单酶类(simple enzyme)结合酶类（conjugated enzyme，全酶、复合酶类）酶蛋白非蛋白组分 金属离子:Fe,Cu,Zn,Mg 辅酶：NAD,NADP,辅酶A(CoA)辅基：FAD,FMN,血红素（Fe）全酶(holoenzyme)=酶蛋白+辅酶（辅基）,酶蛋白决定反应的特异性辅助性因子决定反应的种类与性质,辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,第三节酶催化作用的结构基础,一、酶分子的结构特征,1.酶的活性部位（活性中心，active site/center）酶分子中与底物结合并催化底物生成产物 的部位。酶的催化能力只局限在大分子的一定区域（少数氨基酸残基）,酶活性部位（中心）的特点,活性部位只有几个氨基酸或某些基团组成酶的活性部位是一个三维实体酶的活性中心一般位于分子表面的疏水凹穴内酶活性部位具有柔性和可运动性酶与底物的结合是诱导契合过程酶与底物通过次级键结合,活性部位仅占酶分子总体的相当小部分（1-2%）,某些酶活性部位的氨基酸残基,活性中心的两个功能部位,结合基团(binding group)：与底物相结合 专一性催化基团(catalytic group)：催化底物转变成物 催化能力,催化部位：Glu35、Asp52结合部位：Trp62、Trp63、Asp101、Trp108 AF为底物多 糖链的糖基，位于酶的活性 中心形成的裂 隙中。,溶菌酶（129AA）的活性中心,胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶与底物结合的疏水口袋,2.维持酶活性所必需的氨基酸残基必需基团,在酶分子中有些基团并不位于活性中心，也不与底物直接作用，但它参与维持酶分子的空间构象，是酶表现活性所必需的部位。,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,3.酶活性中心存在的实验证明,（1）切除法 小分子、结构已知酶（2）X-射线衍射分析 对比图谱，直接观察,（3）化学修饰法（共价标记）,恰当化合物：特异结合酶活性部位氨基酸侧链二异丙基氟磷酸（DIFP/DFP）对酶活性部位丝氨酸羟基的修饰,DFP不与Ser195以外的Ser结合,胰凝乳蛋白酶Ser195参与酶-底物共价复合物的形成,碘乙酰胺对巯基的修饰,（4）亲和标记法底物结构类似物共价修饰剂（活性部位指示剂）,修饰剂特点：可专一性引入酶活性部位具活泼的化学基团与酶共价结合机制：酶对底物的特殊亲和力亲和标记试剂/活性部位指示剂,TPCK是胰凝乳蛋白酶的亲和试剂,胰凝乳蛋白酶底物,TPCK与胰凝乳蛋白酶保温后,酶活力完全丧失，共价、定量结合TPCK不与胰凝乳蛋白酶原结合TPCK不与变性胰凝乳蛋白酶结合TPCK不与DIP-胰凝乳蛋白酶结合DFP不与TPCK-胰凝乳蛋白酶结合空间结构完整的活性部位TPCK结合,一些酶的亲和标记试剂,二、酶原及酶原激活,酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原激活 在一定条件下，酶原转化为有活性酶的过程。调控机制，不可逆。,消化系统蛋白酶原的激活,胰蛋白酶抑制剂（胰腺）,胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活,胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,酶原激活的机理,酶原激活的生理意义,1、避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。2、有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,三、影响酶催化效率的有关因素(一)底物和酶的邻近效应(approximation，proximity)与定向效应(orientation),底物分子结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，从而加快反应的速度。一个有机化学模型。咪唑催化对硝基苯酯的水解，分子内反应比分子间反应快24倍。,分子内反应,分子间反应,底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率称定向效应。邻羟基苯丙酸内脂的形成反应，两个甲基使羧基和羟基更好的定向，使反应速率提高2.51011,(二)底物的形变(distortion)和诱导契合(inducednt),（三）酸碱催化（acid-base catalysis）,通过瞬时向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的催化机制。,可作为质子供体或受体的侧链,咪唑基的pK值接近生理pH值，H+的传递速度快，是酸碱催化中最重要的基团。,酸碱催化-胰凝乳蛋白酶,A:酶本身；B：加上底物后，从Ser195转移一个质子给His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互作用被稳定。,（四）共价催化（covalent catalysis）,亲核催化或亲电子催化：亲核/电子催化剂释放/汲取电子，作用于底物的缺电子/电负中心，形成不稳定共价中间复合物，降低活化能。,（五）金属离子催化,几乎1/3酶催化作用需要金属离子金属酶（metalloenzymes）：含紧密结合的金属离子，如：Fe 2+，Fe 3+，Cu 2+，Zn 2+，Mn 2+，Co 3+金属激活酶（metal-activated enzyme）：含松散结合金属离子，如：Na+，K+，Mg 2+，Ca 2+,金属离子的作用,结合底物为反应定向可逆改变金属离子的氧化 态调节氧化 还原反应静电稳定或屏蔽负电荷，降低反应中的静电斥力活化水分子与过渡态底物形成螯合物,第四节酶促反应动力学Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,酶促反应动力学研究酶促反应的速度规律及各种因素对酶促反应速度的影响。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。初速度(v)：在酶促反应过程中，初始底物浓度消耗在5%以内的速度,一、酶浓度的影响,酶最适反应适条件下 当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K E,二、底物浓度对反应速度的影响,1.单底物酶促反应动力学,中间复合物学说,E：enzyme；S：substrate；P：product1903年，Henri以蔗糖酶研究底物与反应速率关系，与Wurtz提出酶底物中间络合物学说,D.Keilin(英)&B.Chance(美)分别获得关于酶-底物复合物存在的比较直接的证据,Chance：植物（辣根）过氧化物酶（棕色-血红素）H2O2H2O+O2吸收管谱检测：底物（H2O2）+棕色酶淡红色的酶-底物复合物加入供氢体后，酶液变棕色酶,溶菌酶-底物复合物结晶X线衍射图,当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。,1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。,S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数(Michaelis constant),米氏方程的推导,前提:中间复合物学说:E+S ESE+P反应方程式:,假设：产物浓度很底时，忽略 E+P EP,Total enzyme：Et=E+ES，E=Et-ES SESt ESSK1 E SK2 ES+K3 ES，即：K1(EtES)SK2 ES+K3 ES,ES分解为限速步骤，v=K3 ES,当底物浓度，酶活性中心全部饱和，即EtES，反应达最大速度：VmaxK3ESK3Et,米氏常数：Km,当：v=1/2 Vmax S=Km(摩尔/升),米氏常数的意义,Km值等于反应速度达最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位，是酶的特征常数，酶对一定的底物只有一个特定的Km:V/2=VS/(Km+S)则 Km=SKm越小酶对底物的亲和力越大，Km最小的底物为最适底物。Km可用于判断反应的方向及代谢途径的限速步骤。,Km值可用来表示酶对底物的亲和力,K2+K3,Km，当 K2 K3 时，,K1,ES,K2,ES,K1,Km,Ks（解离常数）,Km和酶与底物的亲和力成反比,米氏常数的求法,v S 作图法,双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法,Y=aX+b,