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,食用菌生物学实验张志瑾,实验一母种培养基配制及棉塞制作,一.实验目的1、掌握食用菌固化培养基的配制。2、学会棉塞 的制作方法。二、基本原理 食用菌母种分离、移接和斜面保存菌种都必须要制作相应的培养基，以备食用菌的培养、分离和保存之用。培养基是根据各种食用菌在生长繁殖过程中对营养物质需求制成的，它可供给食用菌的C源、N源、水分、各种无机盐及生长物质等。培养基的种类很多，本实验学习斜面培养基（PDA）制作。,三.实验准备1.器具：天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、漏斗架、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、棉花、线绳、牛皮纸、皮筋、纱布、电炉、菜刀、菜板、小铝锅等。2材料：马铃薯、葡萄糖或蔗糖、琼脂、水。四、实验内容 过程：制马铃薯滤液融化琼脂培养基的分装 棉塞的制作 方法步骤：,1配方（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂1520g，自来水1000ml，pH自然。2制作方法（1）制滤液：马铃薯刮去粗皮，去芽眼，切成碎块，称量后放锅中，加水12001300ml，将其煮沸20min。用双层纱布过滤，取1000ml滤液。,（2）化琼脂：将滤液加热至将沸腾时加入琼脂，不断搅拌，注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待琼脂完全融化后加入剩余原料，并使其溶解（用热水补足水量）.,（3分装:通过漏斗装置，趁热将培养基分装于试管中，装量约占试管高度的1/4（分装三角瓶，其,装量以不超过其容积的一半为宜）。注意管口或瓶口不要沾染培养基。（4）制棉塞棉花以白色长绒脱脂棉为宜。根据试管口大小取棉，将其卷成棉塞，最好 外包一层纱布。将棉塞塞入试管口。棉塞塞入试管2/3。制做棉塞要求外表光滑，外包的纱不能折、松紧适宜等。,A.正确;B.不正确,（5）包扎：管口堵入棉塞后7或9支试管扎一捆，棉塞部分用牛皮纸包扎。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。（6）、灭菌（7）、摆斜面（8）、存放冰箱（4-6C）六、作业1、简述高压灭菌锅的使用。2、何谓灭菌？简述热力灭菌的类型和原理。3.何时加入琼脂？融化时注意什么问题？分装的技术要求有哪些？4.棉塞的作用有哪些和技术要求？菌种培养时管口堵胶塞或软木塞行吗？为什么？,实验二、食用菌接种环境的消毒、灭菌与斜面接种一.目的及要求：1.掌握食用菌斜面接种方法及无菌操作技术。2、能正确分析自己的接种效果。二、基本原理：食用菌斜面接种是食用菌栽培过程中最基本的方法之一，也是食用菌制种工作最重要的一个环节。因为在食用菌栽培过程中，一旦斜面接种污染，后面的工作将无法进行，故斜面菌种的接种、分离和移接非常重要，必须在严格无菌操作条件下进行，才能获得纯菌丝体（纯菌）。,三、实验准备1.材料：空白斜面培养基（无菌检验）、母种等 2.器具：酒精灯、接种环、火柴、尖头镊、酒精棉球、大镊子、接种箱、超净工作台、高锰酸钾、37甲醛溶液、紫外灯、2%来苏水、标签纸等。四、实验内容1、接种环境的处理 2、母种的转管技术,五、方法步骤1.接种环境的处理（1）接种箱的熏蒸：先用2%来苏清洁接种箱内外，放入接种所需的物品，用甲醛熏蒸。每立方米空 间 一般用甲醛10ml，加半量高锰酸钾（57g）使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中，再注入甲醛，立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸25-30min。,（2）超净工作台的消毒：用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品，开启超净工作台上的紫外灯，照射20-30分后使用。2.母种的转管技术（1）手及菌种管的消毒：用肥皂洗手，再用75酒精棉球擦手和菌种管表面，在酒精灯焰上略烧试 管 外的棉塞后，立即将菌种管放入接种箱内。（2）转管：两手从接种孔伸人接种箱内，酒精棉球擦拭接种环。左手持菌种管和斜面管，两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种环或针和铲等，并将其在灯焰上干热灭菌，用小指及无名指拔掉棉塞，接种环冷却后伸入菌种管内取略豆粒大菌种块，迅速移人斜面培养基的中部。然后将棉塞在火焰上烧一下，立即塞入试管口，旋紧棉塞。接种环不要触碰管口及管壁。接种后的试管应立即贴标签，注明菌种名称及接种日期，再进行适温培养。,母 种 转 管 过 程,六、作业 1、何谓无菌操作、消毒？消毒分哪几种类型？2、同学相互评比接种结果分析自己接种成败的原因。,实验三、食用菌母种制作分离技术一、目的要求 1、明确食用菌无菌操作技术要点。2、掌握食用 菌母种分离技术。二、基本原理：食用菌母种分离方法较多，但主要采用组织和孢子分离，所不同的是前者取子实体某块组织，后者取子实体的孢子经过培养形成的纯菌丝体（纯种）。三、实验准备 1.材料：空白斜面培养基(空白培养无菌).食用菌子实体等 2.器具：酒精灯、接种环、火柴、尖头镊、酒精棉球、大镊子、接种箱、超净工作台、高锰酸钾 37甲醛溶液、紫外灯、2%来苏水、标签纸等。,四、实验内容1、组织分离 2、孢子分离五、方法步骤1.接种环境的处理（1）接种箱的熏蒸先用2%来苏清洁接种箱内外，放入接种所需的物品，用甲醛熏蒸。每立方米空间一般用甲醛10ml，加入高锰酸钾（57g）使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中，再注入甲醛，立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸20-30min。,（2）超净工作台的消毒用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品，开启超净工作台上的紫外灯，照射20-30min后使用。接入的母种 2.组织分离法 此法是生产中最常用的方法，具有操作简便，菌丝萌发快，分离所得的菌种在培养基条件适宜的情况下，能保持原菌种的优良性状。,（1）种菇消毒在接种箱内，用镊子夹着燃烧的酒精棉球迅速擦拭菇体。（2）取接组织将菇体撕开，用无菌尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒大组织，放入斜面培养基中央,迅速塞上棉塞。3.多孢子分离（1）钩悬法是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离法。在接种箱内将一小块消毒的耳片或菇片悬挂于无菌三角瓶内（装约1cm厚的培养基），在25左右条件下，约24h现孢子粉时以无菌操作法取出分离材料。适温培养后挑取健壮尖端菌丝转管。,（2）孢子印分离法取成熟子实体经表面消毒后，切去菌柄，将菌褶向下放置于灭过菌的有色纸上，在2024静置一天，大量孢子落下形成孢子印，接种环沾少量孢子在试管或平板培养基上划线培养。,4.母种的培养将斜面朝下斜置叠放于瓷盘中，放于培养箱中适温培养。23天后每天都要检查菌丝生长情况。及时挑拣污染试管（出现粘膜或杂色）。5.注意事项：分离的母种一定纯化后再做出菇试验。（1）纯化菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。（2）出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。看产量、质量、形态、长势、抗性如何，经 鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。（3）控制菌龄菌丝 即将长满斜面（一般710天）终止培养。分别用于菌种保藏或繁衍原种。,六、作业1、食用菌菌种分离技术有哪些方法？生产上最常用的是哪一种？2、.孢子分离的母种为何一定要做出菇试验？3.试设计一个分离野生平菇菌种的实验方案,实验四.食用菌原种栽培种培养基（料）的 配 制 与 消 毒 灭 菌 一、目的要求 1、掌握原种、栽培种培养基（料）的类 型。2、学会原种、栽培种培养基（料）的配制方法。二、基本原理,食用菌原种及栽培种培养基的种类很多，根据主料不同分为粮食颗粒、棉子壳、稻草、玉米芯、粪草、木削等多种。原种、栽培种培养基（料）的配制基本相同，所不同的是原种培养基更精细，营养更丰富、更全面，更易被菌丝吸收；栽培种培养基更粗放，更广泛，更接近生产实际。原种、栽培种两菌种的生产过程基本相同，主要区别在于接种时取接的菌种不一样。,三、实验准备 1.材料：棉籽壳、麸皮、蔗糖、石灰粉、过磷酸钙等。2器具；棉塞、打孔棒、菌种袋或瓶、标签、高压灭菌锅、接种箱、消毒药品、线绳等。四、实验内容 1、培养料的配制 2、菌种瓶及菌种袋的 分装,五、方法步骤（一）培养基的配制（1）配方与配制 P102 粮食颗粒培养基（麦粒、玉米粒等）配方：粮食粒98.5%，石膏粉1%，碳酸钙0.5%。配制：将洗净的粮食粒洗净，用1%石灰水泡胀，文火煮沸1520min(熟而不烂，勿 破皮)，捞出晾至无明水后拌入余料。原种多使用颗粒培养基。,棉籽壳麦麸培养基 配方：棉籽壳87%，麦麸10%，白糖1%，石灰1%，过磷酸钙1%。配制：将棉籽壳、麦麸、石灰混合为主料，余料溶解于少量水后浇入主料中。边加清水边翻拌至含水量达60%65%（紧握料的指缝中有水泌出而不下滴）。,（2）分装：原种培养基装入菌种瓶（或其他大口瓶），装量约占瓶高的1/2（非颗粒培养基可装至瓶肩，用锥形棒打一料孔），瓶口擦净，堵棉塞后外包牛皮纸或双层报纸。栽培种培养基一般装入聚丙烯菌种袋，上端套颈圈后如同瓶口包扎法。两端开口的菌种袋可将两端扎活结。装料要求外紧内松，培养料需紧贴瓶壁或袋壁。松散的培养料会导致菌丝断裂及影响对养分、水分的吸收。,（二）培养基的灭菌 原种与栽培种培养基的容器大、装量多，应增加灭菌压力及灭菌时间。高压蒸汽灭菌，一般在压力（1.5kg/cm2）、温度约128.1条件下，保持灭菌时间12h。若采用常压灭菌，需保持最高温度10h左右，再闷1天或1晚。六、作业（料）的配置有何不同？粮食颗粒为何要进行泡和煮？,实验五、食用菌原种、栽培种接种环境消毒、灭菌与接种 一、目的要求 1、掌握接种前的准备工作及原种、栽培种的接种。2、能通过培养观察分析自己的接种结果和存在的问题。二、基本原理 食用菌菌种制作分为三个阶段，即：母钟、原种、栽培种；栽培种是对菌种的再次扩大培养，为食用菌生产提供大量优质菌种，是生产的需求。同时，也使菌种适应大生产用的栽培料和生态环境的需求，通过菌种的多次扩繁提纯以逐级检查菌种的品质，及时存优去劣，以获得高产优质菌种。,三、实验准备 材料器具：一、二级菌种、接种耙铲、大镊子、酒精灯、火柴、酒精棉球、标签、高压灭菌锅、接种箱、消毒药品等。四、方法步骤 食用菌一二级菌种的生产过程基本相同，主要区别在于接种时取接的菌种不一样。（一）接种转管（瓶）灭菌后的原种及栽培种培养基及时运送至无菌环境中，待料温降至约24，进行抢温接种。,（1）接原种用接种耙铲取蚕豆大母种（连同培养基）放于瓶中培养料的孔口处用料盖实（一般1支母种可接10支再生试管母钟；一只再生试管母钟约接58瓶原种）,（2）接栽培种用大镊子、接种铲或接种匙取枣大原种，放于瓶或袋中料面上（若两端扎活结的菌种袋，每端都要接入原种）。1瓶原种约接60瓶或25-30袋栽培种。去弃表面老化菌丝及老种块。堵棉塞或用线绳扎袋口。贴标签，注明菌种名称和接种日期。,（二）培养 接种后将种瓶（袋）置于适温下培养。菌种瓶初放时，应直立于床架上，当菌丝吃料后，再将其横放；菌种袋根据气温可单层或多层叠放，隔45天转动或调换位置，以利于受温一致，并避免培养料水分的沉积；经常检查及时去除出现杂色、粘液及菌种死亡的瓶或袋；逐渐降温当菌丝长至料深的1/2时，降温23，以免料温升高，菌丝生长细弱；注意菌龄原种约30天、栽培种约2030天菌丝长满，再继续培养710天是使用的最好菌龄。,五、作业 1、原种和栽培种培养基（料）的配置有何 不同？2、何谓接种？一只试管种可接多少瓶原种和栽培种？3、菌种的表面有一块残留的琼脂块，证明该菌种是哪级菌种？菌种表面有少许玉米粒或麦粒，证明该菌种是哪级菌种？菌种在适宜条件下培养了十多天，发现有些菌种块丝毫未萌动，请分析原因？,实验六、食用菌制种及栽培中主要病虫害识别综 合观察分析（综合）一、目的要求 能正确识别主要病虫害的形态特征及侵染症状，分析产生的原因，能采取正确的防治方法。二、基本原理 食用菌栽培中，优良的菌种是最关键条件。因此，必须通过各类菌种培养观察中筛选出菌体洁白，生长旺盛，无污染和虫害的纯菌丝体（纯种）用于生产，否则会直接影响产量和质量。,三、实验准备 1、材料：被侵染的培养料和子实体 2、器具：放大镜、显微镜、解剖镜、接种针、尖头镊、载玻片、盖玻片、吸水纸、酒精灯、火柴、无菌水、染色剂等。四、实验内容 1、主要（竞争性）真菌侵染症状的识别 2、主要病虫害的识别,五、方法步骤 1.主要（竞争性）真菌侵染症状的识别。（1）观察：用肉眼和放大镜观察木霉、青霉、曲霉、毛霉、根霉、杂菌的危害症状。（2）镜检：载玻片中央滴半滴无菌水或染色剂，无菌尖头镊取少许污染材料置于水或染 液中，无菌接种针轻轻拨散，放盖片。低倍镜找理想目标，高倍镜下观察各霉菌的形态特征。,木 霉 食用菌的劲敌，后期呈墨绿色,后期,初期,显微镜下,曲 霉（黑曲霉及黄曲霉）黑曲霉孢子成熟后呈黑色，呈黄绿色的是黄曲霉。,青 霉 孢子成熟后呈青绿色,根霉 后期呈黑色（有假根及匍匐菌丝,毛霉 后期呈黑色（无假根及匍匐菌丝，日长速有时达3cm）。,2.主要虫害的识别（1）外观用肉眼和放大镜观察菇蚊、菇蝇、螨虫、线虫等害虫的危害症状。（2）镜检虫卵的观察：载玻片中央滴半滴无菌水或染色剂，无菌尖头镊取少许被害材料置于水或染液中，无菌接种针轻轻拨散，放盖片。低倍镜找理想目标，高倍镜下观察各虫卵的形态特征。虫体观察：将菇蚊、菇蝇、螨虫、线虫等虫体置于解剖镜下观察。,菇蚊的卵、幼虫及成虫,菇蝇幼虫及成虫,菇螨,六、作业 1、绘图比较出木霉、青霉、曲霉、毛霉、根霉、竞争性真菌个体形态特征的异同点。2.结合自己在食用菌制种过程中实验结果综合分析造成发病污染原因。,