发酵工程-第十章-氨基酸课件.ppt

第十章,谷氨酸发酵,工业上重要氨基酸简介,氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。过去都采用,动植物蛋白提取和化学合成法生产，现,18,种氨基酸均可采用,发酵法和酶法生产，不仅成本下降、污染减少，还可组织大,量生产，世界产量每年递增,5,10,。,在氨基酸产生菌选育中，过去多采用诱变育种方法，,诱变结果不易控制，现采用基因工程和细胞融合技术，产量,可成倍、甚至几十倍增加，生产成本大大下降。,如用基因重组构建的苏氨酸、色氨酸“工程菌”，比,原始菌株提高产量几十倍（产酸达,50,60,克,/,升），色氨酸,成本从每公斤,50,美元降到,23,美元。用细胞融合构建的精氨,酸融合株，精氨酸产量达,108,克,/,升，比其他生产菌株高,2,倍,多。,谷氨酸发酵,?,一、概述,?,早期,从天然的食物材料中取得,?,中期,最早商业化制造味精的原料是面筋,?,近期,糖是生产味精的主要原料,二、谷氨酸的生物合成机理,1.,谷氨酸,（,?,-,氨基戊二酸）,O,C-OH,第一代鲜味剂,H,2,N-,C-,H,L-,谷氨酸单钠盐,味精,H-C-H,H-C-H,H-C O,OH,L-,型,葡萄糖,中间产物,a,酮戊二酸,谷,氨,酸,谷氨酸,脱氢酶,NH,4,抑,制,2.,谷氨酸的生物合成,葡萄糖,6-P-,葡萄糖,6-P-,葡萄糖酸,3-P-,甘油醛,5-P-,核糖,丙酮酸,乙酰,CoA,草酰乙酸,柠檬酸,苹果酸,异柠檬酸,延胡索酸,琥珀酸,-,酮戊二酸,谷氨酸,透过细胞膜,谷氨酸,HMP:Hexosemonophosphate pathway,（,1,）,EMP:,丙酮酸，,ATP,NADH,2,（,2,）,HMP:,6,磷酸果糖,3,磷酸甘油酸,NADPH,2,:,?,酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。,（,3,）,TCA,循环,:,生成谷氨酸前体物质,?,酮戊二酸。,（,4,）,CO,2,固定反应,:,补充草酰乙酸。,（,5,）乙醛酸循环,:,使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得,到补充，维持,TCA,循环的正常运转。,谷氨酸脱氢酶,（,6,）还原氨基化反应,:,?,酮戊二酸,谷氨酸,丙酮酸,回补反应,NADH,NAD,+,苹果酸脱氢酶,O,COOH,C,CH,2,COOH,苹果酸酶,NADP,+,CO,2,NADPH,O,CH,3,C,COOH,HOH,C,CH,2,COOH,COOH,3.,谷氨酸生产菌的生化特征,（,1,）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。,（,2,）,?,酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢,酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。,（,3,）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化,NADPH,2,的能力弱。,（,4,）菌体本身利用谷氨酸的能力低。,4.,谷氨酸产生菌（全是细菌）,棒杆菌属,北京棒杆菌,C.pekinense,Corynebacterium,钝齿棒杆菌,C.crenatum,谷氨酸棒杆菌,C.glutamicum,短杆菌属,黄色短杆菌,B.flvum,Brevibacterium,产氨短杆菌,B.ammoniagenes,小杆菌属,嗜氨小杆菌,M.ammoniaphilum,Microbacterium,节杆菌属,球形节杆菌,A.,globiformis,Arthrobacter,共同点：,1,）革兰氏阳性。,2,）不形成芽孢。,3,）没有鞭毛，不能运动。,4,）需要生物素作为生长因子。,5,）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。,三、谷氨酸发酵的工艺控制,（一）培养基,1.,碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃,（,1,）淀粉水解糖的制备,（,2,）糖蜜原料,2.,氮源：铵盐、尿素、氨水,C/N,100,：,15,?,21,，实际高达,100,：,28,因为：,1,）用于调整,pH,。,2,）分解产生的,NH,3,从发酵液中逸出。,产酸阶段：,NH,4,+,不足：使,?,-,酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。,NH,4,+,过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。,3.,无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中,磷酸盐对发酵有显著影响。,不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。,过多：,a.,细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。,b.,促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩,合生成缬氨酸的前体物,?,乙醛乳酸，,使缬氨酸在发酵液中蓄积。,4.,生长因子：生物素,作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。,（,1,）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰,CoA,的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响,磷酯的合成。,（,2,）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：,a.,乙醛酸循环活跃，,?,-,酮戊二酸生成量减少。,b.,转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。,生物素：,B,族维生素的一种，又称维生素,H,或辅酶,R,。是合成脂肪酸所必需的。,脂肪酸的生物合成：,利用乙酰,CoA,（直接原料是丙二酸单酰,CoA,）在乙酰,CoA,羧化酶（辅基为生物素）,催化下合成。,脂肪酸甘油磷酸,磷脂蛋白质,生物膜,因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。,生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷,氨酸透过细胞膜分泌至体外。,使胞内代谢产物迅速排出的方法,1.,用生理学手段,直接抑制膜合成或使膜受缺损,?,如,:Glu,发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌,Glu,；,?,当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉,素的方法；,2.,利用膜缺损突变株,油酸缺陷型、甘油缺陷型,?,如,:,用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有,限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗,漏而提高谷氨酸产量。,?,甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株,低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，,就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量,谷氨酸。,控制细胞膜的渗透性,(1),通过生理学手段控制细胞膜渗透性,(2),通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性,生物素,谷氨酸,细胞膜渗透性,青霉素,谷氨酸,油酸缺陷型,油酸,?,工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，,应采用的最好方法是（,）,A,加大菌种密度,B,改变碳源和氮源比例,C,改变菌体细胞膜通透性,D,加大葡萄糖释放量,为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？,生物素,：乙酰,-CoA,羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。,控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨,酸的分泌和反馈调节。,生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍,Glu,分泌，并引起反馈抑,制，加适量青霉素可提高,Glu,产量。,青霉素,：抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中,肽桥无法交联，造成细胞壁缺损，在膨胀压的作用下代谢物外,渗，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。,（二）,pH,的影响及其控制,作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。,在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵,转向谷氨酰胺发酵。,pH,控制在中性或微碱性。,方法：流加尿素和氨水。,（三）温度的影响及其控制,?,菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体,生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。,?,菌体生长阶段：,30,?,34,?,产酸阶段：,34,?,36,（四）溶解氧的控制,大小由通风量和搅拌转速决定。,发酵产酸阶段，通风量要适量。,不足：发酵液,pH,值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。,过大：,NADPH,2,通过呼吸链被氧化，影响,?,-,酮戊二酸还,原,氨基化，使,?,-,酮戊二酸蓄积。,控制,因子,产物,氧,(,不足,),乳酸或琥珀酸,谷氨酸,(,充足),-,酮戊二酸,(,过量,),NH,+,4,(,不足),-,酮戊二酸,谷氨酸,(,适量,),谷氨酰胺,(,过量,),生物,素,谷氨酸,(,限量,),乳酸或琥珀酸,(,充足,),pH,(,酸性,)N-,乙酰,-,谷氨酰胺,谷氨酸,(,中性或微碱性,),磷酸,盐,(,适量,),谷氨酸,缬氨酸,环境条件引起谷氨酸合成的代谢转换,三、下游过程,（一）谷氨酸的提取方法,1.,等电点沉淀法,（,1,）水解等电点法,（,2,）低温等电点法,（,3,）低温连续等电点法,2.,不溶性盐沉淀法,（,1,）锌盐法,谷氨酸锌离子,谷氨酸锌沉淀,溶液,谷氨酸结晶,pH6.3,加酸,pH2.4,（,2,）盐酸盐法：,Glu,在浓盐酸中生成并析出谷氨酸盐酸盐。,这是用盐酸水解面筋生产谷氨酸的原理。,（,3,）钙盐法：,高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性杂质,分开，降温，析出谷氨酸钙沉淀，加,NaHCO,3,直接得,到味精。,3.,离子交换法,用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳离,子，再用热碱（,60,4%NaOH,）洗脱，,收集相应流分，加盐酸结晶。,GA,+,GA,GA,-,GA,=,2,3.22 7.0 12,pI,谷氨酸是酸性氨基酸，含,2,个羧基,1,个氨,基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交换树,脂强，但阴离子机械强度差，价格贵，因而,用阳离子交换树脂。,理论上讲发酵液上柱的,pH,值应低于,3.22,，,但实际上控制在,5.0,?,6.0,之间，因,Na,+,、,NH,4,+,交换能力,谷氨酸，优先交换，置换出,H,+,使,pH,值低于,3.2,，使谷氨酸成为阳离子，,但不能,6.0,。,4.,电渗析法,膜分离过程，利用的是电位差。,二次电渗析法：,pH3.2,：除去各种盐类。,pH,?,3.2:,除去蛋白质、残糖和色素等非电解质。,（二）味精制造,谷氨酸溶于水,?,活性炭脱色,?,加,Na,2,CO,3,中和,?,谷氨酸单钠（味精粗品）,?,除铁,?,过滤,?,活,性炭脱色,?,减压浓缩,?,结晶,?,离心分离,?,干燥,?,成品,我国味精技术进展情况,制糖工艺进展：,酸法水解酶酸法水解双酶法水解。,发酵工艺进展,：亚适量生物素水平（产酸,4,6g,dl,）,高生物素水平（产酸,12,15g,dl,）。,提取工艺进展,：等电点法（少数锌盐法）等电离交法,低温连续等电点法（少数厂家采用）。,精制工艺进展：,全粉炭脱色、硫化碱除铁颗粒炭脱,色、树脂除铁。,其它氨基酸发酵,一、氨基酸生产工艺控制,1,、,菌种,：,细菌，野生型或营养缺陷型、结构类似物突变菌种；,2,、,培养基,：,碳,源：淀粉水解糖、糖蜜等；,氮,源：铵盐、氨水或尿素，豆饼、麸皮粉；,无机盐：,S,、,P,、,Ga,、,Mg,、,K,等；,生物素：影响细胞膜透性，对氨基酸分泌影响很大，,来,源：玉米浆、麸皮、糖蜜。,一、氨基酸生产工艺控制,3,、,发酵条件控制,P H,：通过流加氨水或尿素来控制；,温,度：菌体生长和产物形成最适温度不同，,并随菌种不同而异；,溶,氧：不同氨基酸发酵有不同要求；,消沫剂：玉米油、豆油或化学合成消沫剂。,一、氨基酸生产工艺控制,4,、,氨基酸分离纯化,过滤：板框；,提取：等电点沉淀；,脱色：活性碳，（过滤除活性碳）；,精制：离子交换或重结晶法。,二、氨基酸（赖氨酸）生产工艺,重点,：,赖氨酸生物合成途径及代谢调节机制；,酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径和调节机制；,赖氨酸生产菌的育种途径。,难点,：,天冬氨酸族氨基酸生物合成的代谢调节机制。,二、氨基酸生产工艺,氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，,然而许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。,按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：,谷氨酸族,（,-,酮戊二酸族）,包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；,丙酮酸族,包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；,天冬氨酸族,（早酰乙酸族）,包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；,磷酸甘油酸族,包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；,芳香族,包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；,另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。,氨基酸的生物合成,1,、天冬氨酸族生物合成途径,天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，,合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。,天冬酰氨,甲硫氨酸,琥珀酰高丝氨酸,合成酶,草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸,-,-,半醛高丝氨酸苏氨酸,异亮氨酸,DAP,合成酶,二氨基庚二酸赖氨酸,2,、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制,在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径,是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。,1,）大肠杆菌,K,12,(,同功酶调节,),天冬氨酸激酶,(,三个,),天冬氨酸,-,-,半醛脱氢酶,(,两个,),DDP,合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）,高丝氨酸合成酶（,HD,）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的,第一个酶）,2,、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制,2,）黄色短杆菌,(,协同反馈抑制,),其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌,简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两,个变构部位，可以与终产物结合，当两种终产,物,同时,过量时，该酶活性受到抑制。,3,）乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节,3,、酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径,就赖氨酸合成途径来讲，不同种类的,微生物途径不同，可以归纳为两条途径：,1,）为经过二氨基庚二酸的生物合成途,径，如细菌，,DAP,；,2,）是,AAA,，酵母菌、霉菌经过,-,氨基己,二酸,AAA,途径合成赖氨酸。,4,、氨基酸生物合成的调节机制,反馈抑制与优先合成,氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈抑制与,在合成途径分支点处的优先合成。,反馈抑制：,A,B,C,D,E,D,优先合成,：,A,B,C,F,G,5,、其他特殊的控制机制,1,）终产物控制,催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种,氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈,抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地,控制。有以下几种情况：,协同（或多价）反馈抑制,合作（或增效）反馈抑制,同功酶控制,积累反馈抑制,5,、其他特殊的控制机制,2,）顺序控制：,E,D,A,B,C,F,G,A,B,C,D,6,、赖氨酸生产菌的育种途径,出发菌株的选择：,要求代谢比较简单的细菌（如黄色短杆菌、,谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）,1,）优先合成的转换：渗漏缺陷型的选育。,2,）切断支路代谢：营养缺陷型的选育。,3,）抗结构类似物突变株的选育（代谢调节突变）。,6,、赖氨酸生产菌的育种途径,4,）代谢互锁,解除代谢互锁的方法：,选育亮氨酸缺陷型菌株，或者以抗,AEC,的赖氨酸的生产,菌为出发菌株，经诱变得到抗,AEC,兼亮氨酸缺陷型菌株。,选育抗亮氨酸结构类似物的突变株，从遗传上解除亮氨,酸对,DAP,合成酶的阻遏。,选育对苯醌或喹啉衍生物敏感菌株，这是一种寻找亮氨,酸渗漏缺陷型菌株的有效方法。,6,、赖氨酸生产菌的育种途径,5,）增加前体物的生物合成和阻塞产物的生成：,方法,：,选育丙氨酸缺陷型；,选育抗天冬氨酸结构类似物突变株；,选育适宜的活性比突变株；,6,）改变细胞膜的透过性,7,）选育温度敏感突变株,8,）应用细胞工程和遗传工程育种,9,）防止高产菌株回复突变,7,、赖氨酸生物合成途径,大肠杆菌的赖氨酸生物合成途径：图,23-2,8,、赖氨酸发酵条件控制,溶氧：特别重要，不足，会使赖氨酸,生产受到不可逆抑制；,PH,：通过补加氨水来控制；,温度：,32,；,前体：甘氨酸或丝氨酸,。（短小假单胞菌）,三、异亮氨酸、亮氨酸生产工艺,1,、,异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径：,图,23-4,2,、异亮氨酸发酵,两种方法：添加前体发酵法和直接发酵法,添加前体发酵法：,苏氨酸脱水酶受异亮氨酸的反馈抑制；,添加前体物质,D-,苏氨酸、,-,酮基异戊酸；,绕过异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制。,直接发酵法：,抗反馈调节突变株，解除对苏氨酸脱水酶的,反馈抑制。,3,、亮氨酸发酵,亮氨酸高产菌株的选育：,1,）选育,-,酮基异丁酸抗性突变株，解除对异亮氨,酸、亮氨酸和缬氨酸生物合成酶系的阻遏作用；,2,）选育异亮氨酸缺陷型回复突变株，,其,-,异丙基,苹果酸合成酶不再受亮氨酸的反馈抑制；,3,）,-,噻唑抗性兼蛋氨酸、异亮氨酸双重缺陷型突,变株，用于亮氨酸的发酵生产。,Thank you,