其他高效液相色谱法-分析化学课件.ppt

1,第十三章 高效液相色谱法,学习目的知识要求能力要求进入章节学习请点这里第1节第2节第3节第4节第5节第6节,2,学习目的,3,知识要求,4,能力要求,掌握高效液相色谱仪的基本结构及仪器的基本操作方法，学会使用高效液相色谱仪对药物进行分离与分析的操作技术。,5,第一节概 述,第一节 概 述 高效液相色谱法（HPLC）的特点：以经典液相色谱法为基础引入气相色谱法的理论和实验技术高压输送流动相高效固定相及高灵敏度检测器现代液相色谱分析方法（具有分离、分析双重作用）,6,第一节概 述,一、与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达1012g。,7,第一节概 述,8,课堂互动,您能比较HPLC与GC和LC的主要区别吗？,第一节概 述,9,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 一、主要类型化学键合相色谱法离子抑制色谱法离子对色谱法离子色谱法亲合色谱法,10,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,二、化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)。化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。,11,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,键合相色谱法的优点：固定相的均一性和稳定性好，使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高。,根据化学键合相与流动相极性的相对强弱分类：分为正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法。,12,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,（一）正相键合相色谱法（固定相极性大于流动相极性）固定相：极性键合相 如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羟基键合硅胶。流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调节剂如烷烃加醇类（正己烷-甲醇）。适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。,13,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,分离机制：分配：把有机键合层看作一层液膜，溶质在两相间溶解。极性强的组分k大，保留时间（tR）长,后洗脱出柱。,14,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,（二）反相键合相色谱法（固定相极性小于流动相极性）固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶。流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂，常用甲醇-水、乙腈-水等。应用范围：较广泛，适用于非极性至中等极性的组分分离。,15,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,分离机制保留行为 主要是利用非极性溶质分子或溶质分子中非极性基团与极性溶剂接触时产生排斥力，而从溶剂中被“挤出”，即产生疏溶剂作用，促使溶质分子与键合相表面的非极性的烷基发生疏水缔合，而使溶质分子保留在固定相中。,16,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,保留行为的主要影响因素溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大；反之亦然。固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。,17,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水（洗脱能力弱）为弱溶剂，醇（洗脱能力强）为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大,18,课堂讨论,欲测定的试样为弱极性分子型有机化合物，您将采用哪种色谱方法，如何选择固定相与流动相？,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,19,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,三、其他高效液相色谱法（一）离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC）通过调节流动相的pH，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，适用于3pKa7的弱酸、7pKb8的弱碱。,20,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,（二）离子对色谱法（ion pair chromatography；IPC）把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。该方法适用于分离可离子化或离子型的化合物，如生物碱类、儿茶酚氨类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物等。,21,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,-,离子对模型,以通式表示为：,22,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,分析酸类或带负电荷的物质，一般用季铵盐；如四丁基铵磷酸盐；分析碱类或带正电荷的物质，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐。,适用范围和离子对试剂的选择,23,（三）离子色谱法（ion chromatography，IC）离子交换色谱法对许多正、负离子可实现分离。但由于一些常见的无机离子在可见或近紫外区没有吸收，因此难用紫外-可见检测器进行检测。1975年Small提出了将离子交换与电导检测器相结合分析各种离子的方法并称为离子色谱法。适用于分离阴、阳离子，以及氨基酸、糖类、DNA和DNA水解物等。,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,24,（四）亲和色谱法（affinity chromatography，AC）亲和色谱法是将具有生物活性的配位基键合到载体或基质表面形成固定相，利用蛋白质和生物大分子与固定相表面上配位基的专属性亲和力进行分离的色谱方法。是生物大分子分离和分析的重要方法。,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,25,课堂互动请您总结正相与反相键合相色谱法的不同点。,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,26,实例分析 牛黄解毒片中黄芩苷（弱酸性）含量测定条件如下：固定相：C18，流动相：甲醇-水-磷酸（4555:0.2）请分析：该试验采用的是哪一种色谱方法？流动相中为何加入磷酸？,第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理,27,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择,一、固定相HPLC的固定相多采用化学键合相。键合相的特点：使用过程中不流失；化学稳定性好；适用梯度洗脱；载样量大。,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择,28,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择,（一）非极性键合相 非极性烃基，如C18C8等键合在硅胶表面；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的k增大，载样量提高，稳定性更好。,29,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及选择,键合反应 硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应,30,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,（二）中等极性键合相醚基键合相用于反相或正相色谱（三）极性键合相常用氨基（NH2）氰基（CN）键合相一般用于正相色谱,31,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,不与固定相发生反应。对试样有适宜的溶解度，要求k在110范围内。与检测器相匹配，例如用紫外检测器时，不能选用对紫外光有吸收的溶剂。纯度高，黏度小。常使用低黏度的甲醇、乙腈，可以降低柱压，提高柱效。,二、化学键合相的流动相,对流动相的要求：,32,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,流动相对分离的影响：,溶剂的配比影响流动相的洗脱能力，改变保留时间；溶剂种类影响流动相的选择性，改变分离效果。正相色谱法：溶剂的极性越强，洗脱能力越强。反相色谱法：溶剂的极性强，洗脱能力弱。,33,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,例如：水的极性大于甲醇，所以在反相色谱法中，甲醇的洗脱能力比水强，增大甲醇的比例，流动相的洗脱能力增强，k与tR减小。,34,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,由于不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，有可能使被分离的两个组分的分配系数不等，所以应采用选择性具有显著差异的溶剂配制流动相，从而获得理想的分离。,35,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,反相键合相色谱法常选用甲醇、乙腈和四氢呋喃为极性调节剂，水为底剂（洗脱强度较弱的溶剂）。一般情况下，甲醇-水能满足多数样品的分离要求，黏度小且价格低，因而是反相键合相色谱法中最常用的流动相。,36,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,正相键合相色谱法常选用乙醚、氯仿和二氯甲烷为极性调节剂，正己烷为底剂。,37,课堂互动 在反相色谱中，如果某组分保留时间较短，且与相邻物质没能达到完全分离，您将如何处理？,第三节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,38,第四节分离条件的选择,第四节分离条件的选择一、高效液相色谱中的速率理论GC中的速率理论方程式：HPLC中的速率理论方程式：H=A+Cmu+Csmu,39,第四节分离条件的选择,涡流扩散项(A)A=2dp 减少固定相颗粒的直径（dp）；采用球形、粒度均匀的固定相，用匀浆法装柱，以减小填充因子（同GC）。,40,第四节分离条件的选择,纵向扩散项(B/u)该项可忽略 B=2rDm 溶质在流动相中的扩散系数（Dm）很小，室温操作，且u大于u最佳。传质阻力项（Cu）固定相传质阻力：CS可以忽略，因df（固定液膜厚度）极小。,41,第四节分离条件的选择,流动相传质阻力：Cm与固定相颗粒粒度（dp）及组分分子在流动相中的扩散系数 Dm有关。Dp越小，Cm越小；Dm越大，Cm越小。要求：dp小，Dm大。静态流动相传质阻力：由部分流动相在固定相微孔内的滞留而产生。静态流动相传质阻抗系数Csm Csm dp2，Csm 1/Dm，DmT/要求:固定相粒度（dp2）、流动相黏度（）都小。,42,第四节分离条件的选择,HPLC中的速率理论可表示为：H=A+Cmu+Csmu 原因：HPLC中流动相为液体，固定相为化学键合相。结果：HPLC的实验条件应该是：小而均匀的球形化学键合相；低粘度的流动相，流速不宜过快；柱温适当。,43,第四节分离条件的选择,课堂互动请回答速率理论方程式在HPLC中与在GC中有何异同？如何选择HPLC的实验条件？,44,第四节分离条件的选择,二、正相键合相色谱法的分离条件固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等流动相烷烃加适量极性调节剂（正己烷-甲醇）,45,第四节分离条件的选择,三、反相键合相色谱法的分离条件,固定相非极性键合相 如C18流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈 等极性调节剂。,46,第五节高效液相色谱仪,第五节高效液相色谱仪,输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统,组成：,47,进样口,检测器,色谱图,色谱柱,溶剂,高压泵,混合器,高效固定相,在线检测,高灵敏检测器,高效液相色谱仪示意图,第五节高效液相色谱仪,48,输液泵应具备的性能：,流量精度高且稳定流量范围宽且可调能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀,第五节高效液相色谱仪,一、输液系统（高压输液泵）,49,第五节高效液相色谱仪,高压输液泵：恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定，常用柱塞往复泵。双泵：为了克服流量的脉动，常用串联式。,50,柱塞往复泵结构示意图1.转动凸轮 2.柱塞 3.密封垫 4.液缸 5.入口单向阀6.出口单向阀 7.流动相入口 8.流动相出口,第五节高效液相色谱仪,51,泵1,泵2,阻尼器,单向阀,串联式柱塞往复泵示意图,第五节高效液相色谱仪,52,等强度洗脱 在同一分析周期内流动相的组成保持恒定，适合于组分数目少，性质差别小的试样。梯度洗脱 在一个分析周期内，程序控制改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。分析组分数目多、性质差别大的复杂试样。,洗脱方式：,第五节高效液相色谱仪,53,第五节高效液相色谱仪,进样器进样阀（六通阀），常用带有定量管的六通阀自动进样装置,二、进样系统,54,充样位置（load),进样位置(inject),来自泵,至色谱柱,来自泵,至色谱柱,废液,废液,六通阀进样示意图,第五节高效液相色谱仪,55,色谱柱（column）由柱管和固定相组成可重复使用实验结束，要用经过滤和脱气的适当溶剂冲洗色谱系统,三、分离系统,第五节高效液相色谱仪,56,第五节高效液相色谱仪,对检测器（detector）的要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）噪音（noise）低线性范围（linear range）宽重复性（repeatability）好适用范围广（通用型、专属型）,四、检测系统,57,第五节高效液相色谱仪,检测原理：朗伯-比尔定律：A=ECl特点：紫外检测器的灵敏度、精密度及线性范围好，不易受温度和流速的影响，可用于梯度洗脱。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。为专属型、浓度型检测器。,（一）紫外检测器(ultraviolet detector),58,固定波长检测器：254nm可变波长检测器：200400（800）nm，光电二极管阵列检测器(photodiode array detector；PDAD)：一系列光电二极管，可以进行波长快速扫描，同时获得样品的色谱图和每个色谱组分的光谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量，判断峰纯度。,第五节高效液相色谱仪,紫外检测器的分类：,59,第五节高效液相色谱仪,（二）荧光检测器(fluorescence detector；FD)特点：选择性好，专属型检测器灵敏度比紫外检测器高（检测限10-10 g/ml）,其他检测器：示差折光检测器、蒸发光散射检测器、安培检测器。,60,第五节高效液相色谱仪,五、数据记录及处理系统,微机采集和分析色谱数据,给出峰宽、峰高、峰面积、对称因子、分离度等色谱参数。,61,课堂互动试说出高效液相色谱仪的基本组成及工作流程。,第五节高效液相色谱仪,62,第六节定性与定量分析方法,一、定性分析方法二、定量分析方法（同GC）：外标法、内标法,第六节 定性与定量分析方法,63,一、学习内容 1.化学键合相色谱法正相化学键合相色谱法：固定相极性大于流动相极性反相化学键合相色谱法：固定相极性小于流动相极性 2.其他高效液相色谱法 离子抑制色谱法；离子对色谱法 离子色谱法；亲和色谱法3.高效液相色谱法（化学键合相色谱法）中速率理论方程表达式：H=A+Cmu+Csmu。,学习小结,64,4.化学键合相色谱法的固定相、流动相及分离条件的选择正相键合相色谱法：固定相为极性，常用氰基、氨基键合相 流动相为非极性，常用甲醇-水 分离溶于有机溶剂的极性至中等极性化合物 反相键合相色谱法：固定相为非极性，常用C18流动相为极性，常用甲醇-水分离非极性至中等极性的分子型化合物,学习小结,65,5.高效液相色谱仪的组成输液系统输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录及处理系统6HPLC定性与定量分析同GC,学习小结,66,目标检测一、选择题1.HPLC与GC比较，可忽略纵向扩散项，主要原因是：（）A.系统压力较高 B.流速比GC的快C.流动相黏度大 D.柱温低2.在反相键合相色谱法中固定相与流动相的极性关系是：（）A.固定相的极性流动相的极性 B.固定相的极性流动相的极性 C.固定相的极性流动相的极性 D.不一定，视组分性质而定,67,3.在反相键合相色谱法中，流动相常用（）A甲醇-水 B.正己烷 C.水 D.正己烷-水4.在正相键合相色谱法中，流动相常用（）甲醇-水 B.烷烃加醇类 C.水 D.缓冲盐溶液,68,5.在反相键合相色谱法中，流动相的极性增大，洗脱能力（）。A.降低 B.增强 C.不变化 D.不能确定6.用ODS柱分析一弱极性物质，以某一比例甲醇-水为流动相时，样品的K值较小，若想增大K值应（）。增加甲醇的比例 B.增加水的比例 C.增加流速 D.降低流速,69,7.下列对反相键合相色谱法的描述，不正确的是（）A.流动相为极性 C.适于分离非水溶性的弱极性物质B.固定相为非极性 D.流动相极性变大，洗脱能力变大8.在反相键合相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间tR将有何变化？（）A.k与tR增大 B.k与tR减小 C.k与tR不变 D.k增大，tR减小,70,本章结束！谢谢！,