吖啶酯标记抗体复合物课件.ppt

第十四章 临床免疫检验自动化分析,免疫检验自动化（automation of immunoassays)是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。,20世纪50-80年代:免疫学检测主要是手工操作20世纪80年代末:随着单克隆抗体技术、免疫标记技术以及计算机技术的出现，自动化免疫分析技术引入临床提高检测灵敏度，增加检测项目缩短检测时间提高实验结果的精确度和准确度,自动化免疫分析仪的共同特点,计算机系统,样本处理系统,自动稀释自动进样自动清洗,主机系统,温育反应系统,信号检测系统,信号处理及数字转换,信号储存分析报告,试剂系统,免疫自动化仪器分析技术,第一节 免疫浊度测定的自动化分析第二节 发光免疫测定的自动化分析第三节 荧光免疫测定的自动化分析第四节 酶联免疫测定的自动化分析,第一节免疫浊度测定的自动化分析,免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。,自动化免疫浊度分析,一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。,一、免疫透射比浊法,（一）原理：,1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。,（二）仪器工作过程,2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。,3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。,（三）方法评价,优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确,不足:抗体用量较大；溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。,用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 m），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。,二、免疫胶乳比浊法,（一）原理：,（二）方法评价,本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。,粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：,三、免疫散射比浊法,原理,式I 中为与入射光成角处散射光强度；和I0为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离；为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。,II042（dn/dc)2 Mc(1+cos)N24,两种散射：Rayleigh-散射（颗粒直径入射光波长:不均匀散射）大多数蛋白质分子直径比光波长小很多，因而只产生Rayleigh-散射Rayleigh散射：散射光的强度与复合物的量呈正比、与入射光波长成反比。,散射颗粒与散射光,散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相对不溶解性；测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位，浊度信号与待测抗原量呈正比。,定时散射比浊法速率散射比浊法,免疫散射比浊法,定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。,(一)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）,1.仪器测定技术要点,检测分两时间进行：预反应阶段-加少量样本与抗体反应，测定第一次散射光信号（7.5-120s）；反应阶段-加入全量待测样本，4分钟内测定第二次散射光信号。第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物颗粒产生的信号峰值，经计算机软件处理转换为待测抗原浓度。,2.抗原过量检测,(1)抗体适当过量(2)对抗原过量进行阈值限定,定时散射比浊法测定原理示意图,速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅12min即可完成。,(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）,速率-指抗原抗体结合反应过程中，每一单位时间内两者结合的速度。,抗原抗体复合物形成表,基本原理：抗原与相应抗体以一定比例混合后，随着反应时间的延长，免疫复合物的总量逐渐增加，而速率的变化由慢快慢，反应时间最快的某一时刻称为速率峰。当反应液中的抗体量保持过剩时，速率峰的高低与抗原含量成正比，仪器自动通过标准曲线将速率峰值转化为所测抗原的终浓度。,速率散射比浊原理图,仪器测定技术要点,开启机器，进行定标 反应阶段 抗原过量检测,图20-6抗原抗体反应散射光峰值的动态变化,抗原过量检测,(三)散射比浊方法评价,散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。,1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的使用,（一）免疫比浊分析的影响因素,免疫比浊分析的影响因素和临床应用,4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位 7.标准曲线制备与质量控制,（二）临床应用,免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。,第二节发光免疫测定的自动化分析,三大经典标记技术,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,1.样本盘2.试剂盘3.温育反应系统4.固相载体清洗和分离系统5.信号产生和检测系统6.计算机数据处理和控制系统,自动化发光免疫分析系统的组成,发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。,基本概念,化学发光:化学能光照发光(荧光):光能,激发能不同:,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,化学发光,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。,化学发光剂,直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,1.吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,N-甲基吖啶酮,2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,三联吡啶钌,电化学发光剂反应原理,酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。,1鲁米诺及其衍生物 2金刚烷衍生物（AMPPD）,1鲁米诺,鲁米诺发光原理,2AMPPD3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,分类：直接偶联：通过偶联反应使标志物分子中反应基团直接连接到被标志物分子的反应基团上。间接偶联：用功能交联剂在标志物分子和被标志物之间插入一条链或一个基团，使两种物质通过“桥”连接成结合物。优点：增加反应活性，减弱空间位阻效应。,发光剂的标记技术,被标志物保持自身的特性（抗体特性），又具有标志物特性（发光/催化发光）,1.碳二亚胺（EDC）缩合法,2.过碘酸钠氧化法,3重氮盐偶联法,4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法,化学发光免疫分析的类型：,一：直接化学发光免疫分析二：化学发光酶免疫分析1.辣根过氧化物酶标记的化学发光2.碱性磷酸酶标记的化学发光三、电化学发光免疫分析,一、直接化学发光免疫分析,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,顺磁性微粒示意图,磁微粒技术,磁微粒在电磁场中分离,磁微粒标记抗体,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带吖啶酯标记物抗体,冲洗后,-夹心法,（1）加入H2O2（pH10）,（2）加入碱（pH10）,直接化学发光的机理,吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理有双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等。,吖啶酯标记化学发光免疫分析仪,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入氧化剂发光 信号检测,吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图,吖啶酯标记化学发光免疫分析方法学评价,反应简单快速，不需要催化剂发光迅速，背景噪音低，敏感性高吖啶酯直接标记抗体发光时间短，对信号检测仪要求高,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,二、化学发光酶免疫分析,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,该仪器采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入信号试剂A和氧化剂B 信号检测,仪器测定技术要点,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫测定示意图,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪,该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定的自动化仪器。,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入AMPPD发光剂 信号检测,仪器测定技术要点,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定示意图,化学发光酶免疫分析方法学评价,测定过程与ELISA相似，仅最后一步酶反应的底物改为发光剂和测定的仪器为光信号检测仪酶标记抗原或抗体结合稳定酶催化鲁米诺、AMPPD等发光剂发出的光稳定，持续时间长，便于记录和测定,（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪,该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发光照射，发出450nm的荧光。,4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）反应原理示意图,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入底物4-MUP 信号检测,碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫测定示意图,电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争法等。,三、电化学发光免疫分析仪,三联吡啶钌Ru(bpy)3 2+分子结构图,电化学发光剂发光的反应原理,磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 电化学发光反应 光信号检测 检测完毕,电化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫测定工作示意图,标记磁颗粒在电场中发光工作示意图,电化学发光免疫分析方法学评价,三联吡啶钌在电场中因不断得到TPA提供的电子，可周而复始发光，持续时间长，信号强度高；三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的理化特性试剂灵敏度高、稳定性好,四、在临床免疫检测中的应用,无论是直接化学发光免疫测定、化学发光酶免疫测定和电化学发光免疫测定，目前都是采用发光技术和免疫反应与计算机技术完美结合的自动化仪器分析。智能化程度高，敏感度高、特异性强、精密度和准确性均高于RIA，特别是检测灵活性高、快速、检测试剂稳定并易于进行质量控制。目前已趋替代RIA而成为免疫检测广泛采用的技术。随着新开发的试剂盒不断推出，其检测的项目越来越多：如内分泌激素、肿瘤标志物、心肌标志物、病毒类标志物、血药浓度、骨代谢和贫血等。,第三节 荧光免疫测定的自动化分析,荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。,时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay,TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛使用。,一、时间分辨荧光免疫分析仪,自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长:10s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光,（一）基本原理,时间分辨检测原理示意图,时间分辨,Eu3+元素激发光谱和发射光谱之间的stokes位移,（二）、stokes位移,Eu3+抗体抗原复合物在反应液中经激发后的荧光信号较弱，必须加入一种增强液(enhancement solution)，使Eu3+抗体抗原复合物的PH值降低至23，以利于Eu3+从复合物上完全解离下来，游离的Eu3+为增强液中的另一种螯合剂所螯合，在协同剂等其它成分的作用下，与增强液中的-二酮体生成一个Eu3+在其内部的保护性胶态分子团，这是一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，它在紫外光的激发下发射很强的荧光，信号的增强效果可达上万倍，该技术使用了解离增强步骤，并且采用了前后两种不同的螯合剂，前一种用于Eu3+与抗体标记，后一种用于与解离下来的Eu3+螯合成新的强荧光发射分子，因此，又将该技术称为解离增强镧系元素荧光免疫(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DELFIA),（三）解离增强原理：,（四）仪器测定技术要点,抗原抗体结合 加入Eu3+螯合抗体 加入酸性增强液 4.信号检测,固相双抗体夹心TRFIA检测过程示意图,1.TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防尘。2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异，应选择应用。,（五）注意事项,荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光 标记物质在溶液中旋转的速度呈反比，与分子大小呈正比，常采用抗原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。,二、荧光偏振免疫分析仪,基本原理,抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比,偏振光和偏振荧光发生示意图,荧光偏振免疫测定工作原理示意图,1.抗原抗体反应 2.偏振荧光强度测定,（二）仪器测定技术要点,1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等因素。2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成分。,（三）注意事项,自动化荧光免疫分析的应用,1.激素：甲状腺激素、甾体类激素 2.病毒性肝炎标志物 3.肿瘤相关抗原 4.小分子药物 5.多肽类,第四节 自动化酶联免疫分析系统,根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通常将全自动酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。,（一）仪器组成和性能,1.条形码识别系统 2.样本架和加样系统 3.试剂架 4.温育系统,5.液路系统 6.洗板系统 7.酶标板读数仪 8.自动装载传递系统 9.计算机管理和信息系统,全自动酶免分析仪中的连体机是将样本处理工作站和全自动酶免分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理。分体机，由于它有一个独立的全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。,（二）仪器评价,采用流水线式操作,自动化分析的选择与应用,一、选择原则-资质-性能-环境条件-检测要求-信息要求-经济效益二、临床应用,免疫浊度分析,免疫检验自动化,定时散射比浊法,速率散射比浊法,散射比浊法,透射比浊法,化学发光免疫分析系统,荧光免疫分析系统,自动化酶联免疫分析系统,直接化学发光免疫分析,化学发光酶免疫分析,辣根过氧化物酶标记的化学发光,碱性磷酸酶标记的化学发光,电化学发光免疫分析,时间分辨荧光免疫测定,荧光偏振免疫测定,