固相膜免疫测定课件.ppt
第十二,第十二章固相膜免疫测定,随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。,第一节 概述,标记免疫测定放射免疫测定 1960酶免疫测定 1970荧光免疫测定 19801990化学发光免疫测定 1990膜固相免疫测定 1990,一、免疫测定分类,免疫浊度测定Ag+Ab AgAb+Ab标记免疫测定 Ag+Ab*Ag Ab*+Ab*（B）（F）,二、免疫测定原理,利用抗原抗体反应检测标本中微量物质抗原+抗体 抗原抗体复合物 Ag+Ab Ag*Ab,三、固相免疫测定,B与F分离,Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*Ab Ab,四、固相膜的特点,多孔性 毛细管作用非共价键高度吸附抗体或抗原 高度敏感性易于漂洗 操作简便,五、常用的固相膜,玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜,六、固相膜的技术要求,孔径：0.20.6 m流速：以ml/cm2/min表示蛋白质结合力：吸附力很强，以g/cm2表示均一性,第二节免疫金标记技术,免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）。,一、胶体金制备,胶体金（colloidal gold）的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液，也称金溶胶（gold solution）。,胶体金的制备及特性,*还原100 ml0.01%HAuCl4 所需量,胶 体 金（Colloidal Gold）1560 nm,优 质,劣 质,胶体金结合物（Conjugate）,膜固相免疫测定的特点,第三节膜载体免疫测定的种类与原理,固相微孔膜测定种类,斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay,DIGFA)免疫层析试验（immunochromatography assay,ICA）斑点ELISA(dot enzyme linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)放射免疫沉淀试验(radioimmunoprecipitation assay,RIPA),一、免疫渗滤测定(IFA),IFA双抗体夹心法测抗原,IFA结果判断,二、免疫层析测定（ICA）,ICA 试剂条,样品垫,结合物垫,NC膜,吸水垫,ICA双抗体夹心法测抗原,ICA间接法测抗体,ICA 结果观察,阳性,阴性,无效,IFA与ICA的比较,IFA 穿流（FLOW THROUGH）ICA 横流（LATERAL FLOW）,GIFA技术的发展（间接法测抗体）,GIFA技术的发展,ICA技术的发展,1990年 ABBOTT公司 胶体硒标记ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原体 彩色胶乳标记ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.13 ng/ml 合成TnT质控点,S,C,TC2 C1,测定线,对照线,半定量测定,三、斑点酶免疫吸附试验 Dot-ELISA,四、酶联免疫斑点试验 ELISPOT,20世纪80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌B细胞和细胞因子分泌T细胞的酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot,ELISPOT)。,ELISPOT 检测原理,细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 CTL 公司生产的 ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。,ELISPOT 分析仪解决以下问题,哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的（此斑点没有 T 细胞研究价值）斑点大小的意义 在对不同细胞因子计数和分析时，如何定义斑点最大和最小尺寸 如何从单个细胞基础上分析 实验精确度有多高？如果一个细胞产生相似的细胞因子，在多大程度上会干扰分析结果？几次重复实验才能使结果更有意义？,ELISAPOT,ELISPOT结果判断,五、免疫印迹法Westernblot法,原理,Westernblot抗原表位可能被破坏而漏检,六、放射免疫沉淀试验,原理,放射免疫沉淀试验抗原表位不会破坏,小 结,固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA、酶联免疫斑点试验、免疫印迹法、放射免疫沉淀试验。,
