核酸的结构和功能Structureandfunctionofnucleicacid-生物化学课件.ppt
核酸的化学组成核酸的分子结构核酸的理化性质及应用,核酸的结构和功能Structure and function of nucleic acid,1 核酸的种类分布和化学组成,1.1 核酸的发现及其生物学功能1.2 核酸的种类和分布1.3 核酸的化学组成,1.1 核酸的发现及其生物学功能,1868年瑞士科学家F.Miescher提取到一种富含磷的酸性有机物称为核素（Nulein）.1889年，Altman等从酵母和动物的细胞核中得到了不含蛋白质的称为核酸(nucleic acids).1944年O.T.Avery等的肺炎双球菌转化实验，证明了DNA就是遗传物质。1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质,1.1.1 格里费斯(Griffith F.，1928)：,肺炎双球菌定向转化试验：无毒IIR型 小鼠成活 重现IIR型 有毒IIIS型 小鼠死亡 重现IIIS型 有毒IIIS型(65杀死)小鼠成活 无细菌 无毒IIR型+有毒IIIS型(65杀死)小鼠死亡 重现IIIS型结论：在加热杀死的S型肺炎双球菌中有较耐高温的转化物质能够进入R型 IIR型转变为S型 无毒转变为有毒。,1952年A.D.Hershey和M.Chase用35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质,1.1.2 A.D.Hershey M.Chase（1952年）,核酸作为遗传信息的载体，负责遗传信息的储存、传递和表达。,1.2 核酸的种类和分布,核酸 核糖核酸nucleic acid ribonucleic acid RNA 核糖体RNA（ribosome RNA,rRNA）信使RNA（messenger RNA,mRNA）nucleic acid 转运RNA（transfer RNA,tRNA）脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid DNA,DNA 主要存在于细胞核，是染色质的主要成分；原核生物DNA主要存在于类核（nucleoid）中；核外也存在有少量DNA，如线粒体、叶绿体、质粒（plasmid）。RNA 主要存在于细胞质(90%)，少量存在于核仁中 mRNA 存在于细胞质上清液中，占总RNA的510%。tRNA 存在于细胞质上清液中，占总RNA的1015%rRNA 存在于核糖体中，占总RNA的7580%；,核酸核苷酸核苷 磷酸碱基（嘌呤和嘧啶）戊糖（核糖或脱氧核糖）,1.3 核酸的化学组成,核苷酸,碱基,核糖或脱氧核糖,磷酸,核糖或脱氧核糖,核糖或脱氧核糖,核糖环上的编号,嘧啶,嘌呤,腺嘌呤 鸟嘌呤,胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶,脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,稀有碱基,稀有碱基,假尿嘧啶,次黄嘌呤,7-甲基鸟嘌呤,硫尿嘧啶,磷酸与核苷的不同连接,ATP ADP AMP,ATP ADP AMP dATP dADP dAMPGTP GDP GMP dGTP dGDP dGMPCTP CDP CMP dCTP dCDP dCMP UTP UDP UMP dTTP dTDP dTMP,游离核苷酸及核苷酸衍生物：除形成核酸外，细胞内还存在多种游离核苷酸及核苷酸衍生物。比如第二信使cAMP，辅酶NADH等。,2 核酸的分子结构,2.1 DNA的分子结构2.2 RNA的分子结构,2.1 DNA的分子结构,DNA的一级结构 DNA的二级结构 DNA的三级结构,DNA的一级结构,DNA的一级结构指的是组成DNA分子的脱氧核苷酸的连接方式和排列顺序。DNA是由很多个dAMP、dGMP、dCMP和dTMP通过3,5-磷酸二酯键连成的无分支双链线状或环状多核苷酸。E.coli DNA 4106bp，1.4 106nm；人DNA 2.9 109bp 9.9 108nm,方向,RNA易降解,核酸链示意图（线条式）,5pApCpTpTpGpApApCpG3 DNA5pApCpUpUpGpApApCpC3 RNA简化为：5pACTTGAACG3 DNA5pACUUGAACG3RNA,核酸的文字表述方式,由四种脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连成不分枝的多聚核苷酸链长链。戊糖和磷酸构成了DNA的主链，碱基不参于主链而是向外伸出形成侧链，主链单调重复，侧链千变万化。一级结构中重要的是核苷酸的组成（数量）和排列顺序（碱基序列）。不同的DNA有不同的碱基组成和排列顺序，这是构成DNA作为遗传物质的关键因素。,一级结构的基本特征,DNA的二级结构,DNA双螺旋结构的主要依据双螺旋结构特征双螺旋结构的稳定因素DNA二级结构的多态性,DNA双螺旋结构的主要依据,Chatgaff规则1949-1951年Chatgaff应用紫外分光光度法和纸层析等技术，对不同来源的DNA进行碱基定量分析，得出组成DNA四种碱基的比例关系。不同来源的DNA中A=T、C=G；A+G=T+C。,不同来源DNA碱基组成的比例关系,X光衍射测定DNA结构Wilkins及其同事Franklin等用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。碱基之间可能存在氢键 用电位滴定法证明DNA的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的-NH、-CO则不能滴定，因此它们之间形成氢键。,脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接成反向平行的两条主链，它们绕一共同轴心向右盘旋形成双螺旋构型。形成大沟和小沟。螺旋直径2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相邻碱基对平面的间距0.34nm。,双螺旋结构特征,碱基位于螺旋的内则，它们以垂直于螺旋轴的取向。磷酸和戊糖位于外侧，彼此间通过磷酸二酯键连接，形成DNA的骨架，糖环平面与中轴平行。,同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。A-T、G-C间以氢键配对。A-T间形成两个氢键，G-C间形成三个氢键。,双螺旋结构的稳定因素,DNA结构稳定的最主要因素是碱基堆积力。层层堆积的芳香族碱基上的电子云交错形成了碱基堆积力，使DNA双螺旋结构内部形成疏水核心而不存在游离的水分子。碱基间的氢键。双螺旋外侧带负电荷的磷酸基团同带正电荷的阳离子之间形成的离子键可减少双链间的静电斥力，因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。在原核生物中DNA通常和多胺类物质结合，在真核生物中则与组蛋白结合。,动画,二级结构的多态性,三链DNA,DNA的三级结构,正超螺旋 左旋,负超螺旋 右旋,从DNA到染色体,见动画,2.2 RNA的分子结构,tRNArRNAmRNA,tRNA结构,tRNA分子中含有氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环和TC环,氨基酸臂：7bp组成，富含G，5-pG或pC，3-CCA-OH，氨基酸连接在腺苷酸残基(A)上。TC环：由7个碱基组成，参与tRNA与核糖体表面的结合额外环或可变环：碱基种类和数量（318个碱基）高度可变，富含稀有碱基。环大小与生物种类有关，tRNA分类的指标。反密码子环：由7个碱基组成，处于中间位的3个碱基为反密码子，常含有次黄嘌呤核苷酸。反密码子可与mRNA中的密码子结合。毗邻反密码子的3端碱基往往为烷化修饰嘌呤，其5端为U，即：U-反密码子-修饰嘌呤。,rRNA结构,rRNA分子量为103-106D，存在于核糖体中，核糖体中有60%是rRNA，其余40%是蛋白质,占总RNA的75%-80%。原核生物大肠杆菌的rRNA有5S、16S和23SrRNA三种，动物细胞有5S、5.8S、18S和28S rRNA四种。,RNP结构,5SRNA结构,mRNA结构,mRNA是蛋白质生物合成的模板,是遗传信息的传递者.每一种蛋白质多肽链由一种特定的mRNA编码，故细胞内mRNA种类很多，但每一种mRNA的数量却很少（5%以下），瞬时含量低，代谢率高。分子大小差异很大.,帽子结构区5非编码区编码区3非编码区polyA尾巴,原核生物,真核生物,帽子结构m7GPPPN，m7GPPPNm，m7GPPPNmNm,尾巴结构,3 核酸的理化性质及应用,3.1 核酸的一般性质3.2 核酸的紫外吸收3.3 核酸的变形复性和分子杂交,3.1.1 溶解性3.1.2 电性3.1.3 粘度3.1.4 电泳3.1.5 核酸的水解3.1.6 核酸的酸碱性质,3.1 核酸的一般性质,3.1.1 溶解性：RNA为白色粉末状，DNA是白色纤维状固体，二者均溶于水，而不溶于一般有机溶剂中，故常用冷乙醇从水溶液中将核酸沉淀出来。(核蛋白)3.1.2 电性：核酸是两性电解质，但酸性强，与金属离子结合成盐，也可与碱性蛋白（组蛋白）结合；介质pH大于4时，呈阴离子，电泳时向阳极移动；DNA在pH411间最稳定，超出此范围易变性。,3.1.3 粘度：大多数DNA为线性分子，长度可达数厘米，直径仅为2nm，故DNA溶液粘度很高，分子极易断裂；RNA溶液粘度较小。3.1.4 电泳：由于核酸核酸在中性或碱性环境下带负电荷。因而可以利用电泳对核酸进行分离。电泳介质有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。电泳后的染色通常利用一种叫溴化乙锭的试剂，该分子呈扁平形，可插入核酸分子的碱基间。紫外线照射下会发出红橙色荧光。,3.1.5 核酸的水解,核酸带有糖苷键和磷酸二酯键，故可被酸、碱、酶水解嘌呤碱的N9或嘧啶碱的N1与戊糖的C1形成糖苷键磷酸基与2种戊糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸酯,酸 水 解,糖苷键和磷酸二酯键都能被酸水解糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键,碱 水 解,RNA的磷酸二酯键易被碱水解，产生核苷酸DNA的磷酸二酯键不易被水解。,3.1.6 核酸的沉降特性,溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。不同构象的核酸（线形，开环，超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。,3.2 核酸的紫外吸收性质,核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于260nm处。可定量测定核酸的含量或鉴定核酸的纯度。纯DNA：OD260/OD280=1.8纯RNA：OD260/OD280=2.0,3.3 核酸的变性、复性、分子杂交,核酸的变性是指因某些理化因素的影响使维持核酸空间结构的氢键和疏水键断裂，双螺旋结构解体，但不涉及核苷酸间共价键的断裂。核酸变性后，粘度降低，紫外吸收值增高(增色效应)，生物功能消失。,增色效应 核酸热变性时，紫外吸收随之增强的现象。减色效应 核酸复性时，紫外吸收随之减弱的现象。,可引起核酸变性的因素由温度升高引起的变性称热变性。由酸碱度改变引起的称酸碱变性。尿素和甲醛也是核酸变性剂。前者常用于DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳时DNA的变性,后者常用于琼脂糖凝胶电泳中的变性。提高离子强度，可以起到防止变性的作用,Tm,DNA的热变性过程中光吸收达到最大吸收一半时的温度称为DNA的解链温度(melting temperature，简写Tm)或熔点,影响Tm的因素DNA的均一性：影响Tm值范围，碱基组成的均一性，DNA样品的纯度。含量：G碱基对之间有三个氢键,而碱基对之间有二个氢键,因此含量高的DNA,值也高。测定值可推算出对的含量,其经验公式为:(-)(-.)介质离子强度：介质离子强度较低,的也低。在较高离子强度的介质中,值也高。,复 性,变性DNA在适当的条件下(除去变性因素)，可使两条分开的链按照碱基配对规律重新缔合成双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响。一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是及不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。,分子杂交,是应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性（即具有碱基互补关系）的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子的过程。,Southern Blot,思考题,写出以下分子的结构 ATP 3,5-cAMP假尿苷 dGTP CTP m7G2.DNA双螺旋结构的基本要点及维持DNA双螺旋的主要作用力。3.变性、复性、分子杂交的概念及机制。增色效应、减色效应的概念及成因。,
