液相色谱的新进展—超高效液相色谱课件.ppt
液相色谱新进展 超高效液相色谱,Waters公司的UPLC:Ultra Performance Liquid Chromatography(超高效液相色谱）Agilent公司的RRLC:Rapid Resolution Liquid Chromatography（快速高分离度液相色谱）,一、定义：,用细粒径填料（sub-2m)、细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m)的液相色谱技术，简称超高效液相色谱,为什么关注小颗粒色谱填料？,根据Van Deemter方程H=A+B/v+Cv,颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高提高分离速度,二、基本原理,节约时间节约溶剂超高灵敏度超高分离度缺点：高压力 Agilent RRLC 约450bar Waters UPLC 约700bar,优点：,三、优缺点：,西洋参成分的分离比对,HPLC,UPLC,4.6250mm，5m,2.150mm，1.7m,1、提高分离速度,小颗粒填料的速度优势 分离度RSL/dp，即保持L/dp，同比缩短柱长,以提高分离速度 提高流速小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度提高速度的辅助手段温度,不同色谱柱和温度的分离速度比对,2、提高分离度和灵敏度,提高L/dp（dp变小）提高柱效提高分离度对于4.6150mm，5m色谱柱，L/dp 30对于4.6150mm，1.8m色谱柱，L/dp 83.3-改善分离度，保持分离速度对于4.6100mm，1.8m色谱柱，L/dp 55.6-改善分离度，提高速度,分离度：颗粒对药物杂质分离的影响,改善分离度和灵敏度,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,1、分离目标化合物：根据中国药典（2005年版）确定分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1，结构如下：,2、药典色谱条件样品：西洋参提取液仪器：Agilent 1100高效液相色谱系统流动相：以乙腈为流动相A，以0.1磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,色谱柱：ZORBAX SB C18 4.6150 mm，5m柱温：40 C 流速：1.0 mL/min 检测波长：203 nm 进样量：5L,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,HPLC色谱柱规格:4.6 x150 mm，5m,(L/dp=30)。根据L/dp值初步确定RRLC色谱柱规格：4.6 x 50mm，1.8m，(L/dp28）故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。,3、色谱柱的选择：,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,4、方法转换的初步参数确定,在Method Translator相应栏目中输入原始HPLC条件，包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。,五、方法优化：由于人参皂苷Rg1、Re未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,6、RRLC色谱条件确定：RRLC色谱条件：Agilent 1200高分离度快速液相色谱(RRLC)，色谱柱：ZORBAX SB C18 4.6x50mm,1.8um流动相：A:0.1%H3PO4，B:乙腈，梯度分离柱温：25C 流速：2mL/min 检测波长：203nm 进样量：5L,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,7、西洋参分析：HPLC与RRLC分离色谱图比较,在RRLC系统上可以实现HPLC分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显著改善分离灵敏度。温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间,四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）,8、结论,五、展望及结语,填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和通量。提高温度（流动相的粘度和温度成正比，适当的提高温度可进一步降低压力，同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。但要注意安全性。）总之，随着商品仪器的应用及逐渐推广，超高效液相色谱将成为复杂样品分析的一个强有力的工具。,谢谢!,Thank you for your attention,
