荧光显示细胞器和细胞凋亡课件.ppt
荧光显示细胞器和细胞凋亡,荧光显示细胞器和细胞凋亡荧光显示细胞器和细胞凋亡细胞器的荧光标记熟悉荧光标记各种细胞器的常用方法及原理 掌握荧光显微镜下各种细胞器的形态及分布膜相结构细胞膜核被膜线粒体内质网高尔基体溶酶体过氧化物酶体非膜相结构细胞骨架微管微丝中间纤维核骨架，核纤层细胞结构染色质，染色体，核仁，核糖体,Fluorescent DyeExcitation（激发频谱，nm）Emission（发射频谱，nm）BODIPY530/550 530550Dil 549565BODIPYTMR 542568BODIPY558/568 558568BODIPY564/570 564570Cy3TM 550570TRITC 547572Magnesium OrangeTM 550575Phycoerythrin,R&B 565575Rhodamine Phalloidin 550575Calcium OrangeTM 549576Pyronin Y 555580Rhodamine B 555580Rhodamine RedTM 570590Cy3.5TM 581596ABI,ROX 588608Calcium CrimsonTM 590615,Fluorescent DyeExcitation（激发频谱，nm）Emission（发射频谱，nm）Texas Red595615 Nile Red549628 YO-PROTM-3612631 YOYOTM-3612631 R-Phycocyanin618642 C-Phycocyanin620648 TO-PROTM-3642660 TOTO-3642660 DiD DilC(5)644665 Cy5TM649670 Thiadicarbocyanine651671 Cy5.5675694,1.细胞核的荧光显示 P60-62,吖啶橙（Acridine Orange)吖啶衍生物之一，它既可嵌入DNA双链间与双链DNA结合，经蓝光激发后发出亮绿色荧光，又可以静电堆积的方式与单链DNA或RNA 的磷酸根结合，蓝光激发下发出橘红色荧光，从而清晰的显示DNA,RNA。,异染色质（核内深染）和常染色质（核内浅染）,实验方法:P62,1.将生长有培养细胞的盖玻片（注意细胞面向上）置于一次性小培养皿内，加入95乙醇固定1530分钟，取出自然干燥；2.加入1醋酸酸化30秒；3.在盖玻片标本上滴加0.01吖啶橙染液，染色510分钟；4.去染液，用磷酸缓冲液冲洗1分钟；5.用1/10氯化钙分化30秒3分钟；6.用PBS漂洗玻片3次，每次数秒；7.临时封片：滴12滴PBS于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。,细胞核呈绿色（DNA),细胞质呈橙红色。,2.线粒体的荧光标记 P70,罗丹明123特异性的线粒体荧光染料,是膜电位敏感的阳离子荧光素，活细胞线粒体具有大量质子积累造成的外正内负跨膜电位，吸引染料并将它保持在线粒体中,经蓝光激发,呈现黄绿色荧光.可作为线粒体膜电位的灵敏指示.,罗丹明123结构式,电子传递和氧化磷酸化的偶联,实验方法:P71,取出已培养好细胞的盖玻片，用PBS(+)冲洗3次，每次漂洗浸泡2-3分钟，2.加入罗丹明123标记液，37培养箱孵育15分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次3-5分钟，4.临时封片：滴12滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。,细胞核附近发绿色荧光的圆形或短杆状颗粒即为线粒体,3.内质网的荧光标记 P64-67,1.材料 培养细胞爬片2.试剂 储存液：0.5mg/mL DIO-C6(3)存储液，4避光，标记液：2.5ug/mL DIO-C6(3)，4避光。0.5%戊二醛,实验方法:P67,取出已培养好细胞的盖玻片，用0.5%戊二醛PBS溶液固定细胞10分钟，2.吸去固定液，用PBS液洗3次，每次漂洗时浸泡 3-5分钟2.滴加DIO-C6(3)荧光染液，室温染色1分钟，3.吸去标记液，PBS液洗3次，每次5分钟，4.临时封片：滴12滴缓冲液于载玻片上，将含细胞的盖玻片反扣其上，置荧光显微镜下用100X物镜观察。,4.细胞凋亡,细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed cell death简称PCD），是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同。细胞凋亡是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承担着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、发展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。,细胞凋亡与坏死的区别,细胞凋亡形态学观察荧光显微镜观察法Hoechst33258染色法,1.材料：CHO细胞2.器材：细胞培养所需设备，荧光显微镜。试剂(1)细胞凋亡诱导剂：放线菌素D 5mg粉剂用1mLDMSO（二甲亚风）浓度(5mg/mL)充分溶解，分装-20避光保存，(2)Hoechst33258染液：称取Hoechst33258 1mg,用20mL蒸馏水溶解，过滤，4避光保存。用时用蒸馏水10倍稀释成染色液，pH 7.0(3)固定液：4%多聚甲醛(4)PBS液,放线菌素D是一种抗肿瘤的抗生素类药物。通过脱氧鸟苷残基与DNA形成复合物，从而抑制DNA依赖的RNA聚合酶的活性，阻断转录过程。是多种哺乳动物细胞强有力的凋亡诱导剂.分子式:C62H86N12O16 分子量:M.W.1255.5溶解度:溶于 DMSO,MeOH 或CHCl3.，红色晶体。,操作方法,1.贴壁细胞培养：将盖玻片置于小培养皿内，接种细胞培养过夜，2.细胞换液并加入细胞凋亡诱导剂：放线菌素D 2uL浓度(10ug/mL)继续培养24h，3.取出小培养皿，吸尽培养液，加入固定液(4%多聚甲醛)0.5mL固定10分钟，4.去固定液，用PBS液洗2次，每次3分钟，洗涤时摇动，5.吸尽液体，将盖玻片正面向上放在载玻片中央，加入20uL Hoechst33258染色液，染色5分钟，6.去染色液，盖玻片置于小培养皿内，用PBS液洗2次，每次3分钟，洗涤时摇动，7.在载玻片中央加入1-2滴PBS液,将盖玻片反扣放在载玻片中央（长有细胞的面向下），尽量避免气泡产生，8.荧光显微镜观察：350nm 激发光观察，发射波长约460nm,活细胞呈均匀荧光，早期凋亡细胞：呈现细胞皱缩，胞膜完整，染质加深，或核染色质不均匀分布，呈聚集于核膜一边；晚期凋亡细胞：表现为核碎裂成大小不等的圆形小体，并被细胞核膜所包裹，即凋亡小体(Apoptotic bodies)，显示核或细胞质内浓染致密的颗粒块状荧光。,31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。黑格尔32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。普列姆昌德33、希望是人生的乳母。科策布34、形成天才的决定因素应该是勤奋。郭沫若35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。洛克,
