第二章-基因工程原理-课件.ppt

第二章 基因工程原理,第一节 基因工程的概念及其主要内容第二节 基因工程中的工具酶第三节 基因克隆的质粒载体第四节 目的基因的分离第五节 基因与载体的重组与导入受体细 胞第六节 重组体的筛选,第一节 基因工程的概念及其主要内容,基因决定性状（一）青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素,基因决定性状（二),家蚕能够吐出蚕丝为人类利用,基因决定性状（三）,豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。,返 回,一 基因工程概念,基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。,主 页,基因工程(gene engineering)常和以下名称混用,遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。,二、基因工程的主要内容或（步骤）,1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,基因工程过程示意图,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒,DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,返 回,由此可见，一个完整的基因工程包括基因的分离、重组、转移，基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程。基因工程的实施至少要有4个必要的条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。,三、基因工程技术及其应用,转基因植物,转基因动物作为生物发生器,第二节 基因工程中的工具酶,基因工程的工具酶就其用途可分为3大类，即限制性内切酶、连接酶和修饰酶。,2.1 限制性内切酶,限制性内切酶(restriction endonuclease)是一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中特定的核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P集团DNA片段的内脱氧核苷酸酶。,Restriction enzymes,As biological scissors,2.1.1限制性内切酶在DNA分子上的识别序列,限制性内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序称之为识别序列，有时称之为识别位点。识别序列多数由4、5、6个核苷酸组成，如Dpn、Apy和EcoR的识别序列分别是GATC、CCTGG和GAATTC。,2.1.2 限制性内切酶的酶切位点,限制性内切酶具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。,不同限制性核酸内切酶切割的三种情况,1.产生3突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：5-G AATTC-3 5-GP OHAATTC-3 3-CATAAA G-5EcoR I 3-CTTAAOH PG-52.产生5突出粘性末端:以Pst I为例：5-CTGCA G-3 5-CTGCAp OHG-3 3-G ACCTC-5 Pst I 3-GOH p ACGTC-53.产生平末端（blunt end):以Nru I为例：5-TCG CGA-3 5-TCGp OHCGA-3 3-AGC GCT-5 Nru I 3-AGCOH pGCT-5,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。,返 回,几种最常用的限制性核酸内切酶,EcoRI binds to the GAATTC sequence andcuts the DNA,creating DNA fragments.,2.1.3 限制性内切酶反应系统,限制性内切酶反应底物是DNA分子，但只含识别序列的寡核苷酸是不会被切割的。如只含GAATTC的寡核苷酸不会被EcoR切割，只有在识别序列两侧个延伸1个或几个核苷酸后才能被EcoR切割。所以人工合成的EcoR连杆不是GAATTC，而是GGAATTCC。限制性内切酶反应系统的缓冲液因酶而异,常用的缓冲液有A、B、L、M、H等几种，厂家出售限制性内切酶时提供相应的缓冲液。限制性内切酶反应温度多数是37，少数低于或高于37。,2.2 DNA连接酶,用于将两片段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为DNA连接酶。基因工程中最常用的酶是T4DNA连接酶，它催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键，其用途是：连接带匹配粘末端的DNA分子。使平端的双链DNA分子互相连接或与合成的寡核酸头相连接。,DNA连接酶的作用过程,返 回,2.3 用于基因工程中的修饰酶2.3.1 DNA 聚合酶,目前常用的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶、大肠杆菌DNA 聚合酶大片段（Klenowfragment）、噬菌体聚合酶、噬菌体聚合酶以及耐高温的聚合酶（如TaqDNA聚合酶）等。反转录酶是一种依赖于的聚合酶。反转录酶在基因工程中的用途主要是以真核mRNA为模板合成cDNA，用于组建DNA文库,进而分离为特定蛋白质编码的基因。另外，将与偶联建立起来的反转（），使真核基因的分离更加有效。DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶，简称末端转移酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的羟基端，主要用于给载体或cDNA加上互补的同聚尾，便于外源基因重组。,第三节 分子克隆的质粒载体,质粒的一般生物学特性；质粒DNA的分离与纯化；质粒载体的构建及类型；常用质粒载体举例；,一、质粒的一般生物学特性,（一）、质粒DNA1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。,（二）、质粒的拷贝数与不亲和性,1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。,二、质粒DNA的分离与纯化,三、质粒载体的构建及类型,质粒载体的发展概况；质粒载体的特点（基本条件）；遗传标记基因质粒载体的类型,（一）发展概况,1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivar et al)2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,（二）载体特点,1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。注：前三个特点必不可少。,（三）遗传标记基因,1、标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。*这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（lacZ），绝大多数为后者。,2、标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1)四环素抗性基因（Tetr，Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2)氨苄青霉素抗性基因（Ampr，Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。,3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,5）半乳糖苷酶基因（lacZ）lacZ中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的lacZ基因产物（链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ-肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。,LacZ基因的结构与产物,（四）、质粒载体的类型,1、根据载体的分子生物学特性划分（1）.质粒型载体环状dsDNA分子，自主复制（2）.病毒型载体环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒（3）.混合型载体具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性,2、根据载体功能划分（1）.普通型载体 1)特点:至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。2)用途:基因组或cDNA文库的构建;次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。例子:pBR322和pUC载体。上述两例中的非重组子来源有两个：a.酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子 b.酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子,普通型载体pBR322的结构图,pUC18和pUC19载体,（2）、表达型载体（expression vector）1)特点:a.基因的启动子序列和终止子序列；b.一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2)结构:a.转化单元-宿主细胞转化 b.表达单元-外源基因表达 3)类型:型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子 型:转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子 型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）,三种表达型载体结构图,显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定,表达载体的类型也就确定了。4)用途:a.表达外源基因以产生大量外源基因产物 b.用于构建cDNA文库,四、常用质粒载体举例,1、pBR322载体2、pUC载体,1、pBR322载体,优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,筛选重组子的示意图,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,2、pUC18和pUC19,pUC系列质粒载体具有三个显著特点：（1）、分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。（2）、含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）、多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,pUC18和pUC19载体,利用菌落颜色筛选重组子,分子克隆载体的选择,1.选择克隆载体的几个重要参数（1）实验对象（2）实验性质（3）载体容量（4）合适克隆位点（5）载体的稳定性（6）载体DNA制备的难易（7）外源基因表达产物产量、产物特点等,2.实验对象,（1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。（2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如：E.coli DH5、E.coli DH5、E.coliDH5F 1）三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组2）DH5和 DH5F都具有一个可供遗传标记lacZ检测的遗传背景3）DH5F可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F的存在,3.实验性质,分子克隆的一般程序包括以下几步：（1）分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA（2）构建基因文库或cDNA文库（3）目的基因或cDNA 克隆的筛选（4）目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等（5）基因表达与调控机理的研究,1)建立文库用载体 常在E.coli 进行 i.目的基因与供体基因大小 小质粒载体，操作方便，鉴定简单 大或cos质粒载体,甚至pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用和cos载体）ii.筛选方法)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性)杂交法：各种载体均可2)目的基因的鉴定 次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等 定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体）3)基因表达与调控 外源基因可表达普通载体;不表达表达型（分泌）载体,4.载体容量 M13mp载体 4 kb 细菌质粒载体 10kb 载体 23kb cos质粒载体 48kb P1载体 95 kb pYAC载体 1000 kb5.合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点,