细胞的传代冻存复苏课件.ppt

细胞传代、冻存与复苏,细胞培养的基本概念,?,传代：,?,细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新,的培养器皿中。,?,原代培养,?,取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传,代之前称为原代培养。,?,原代培养细胞的生命归宿,?,原代培养期,?,传代期,?,衰退期,?,有限细胞系，无限细胞系,?,细胞系,cell line,?,细胞株,cell strain,?,初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。,如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（,Finite,Cell,Line,）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞,系或无限细胞系（,Infinite,Cell,Line,）。,?,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选,的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,培养细胞的特性,?,培养细胞的生长方式,?,贴附生长：,?,必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体,瘤细胞,?,悬浮生长：,?,于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表,面。见于各种造血系统肿瘤细胞,每代贴附生长细胞的生长过程,?,游离期,?,贴壁期,?,潜伏期,?,对数生长期,?,停止期（平台期）,?,游离期：,?,细胞接种后在培养液中呈悬浮,状态也称悬浮期。此,时细胞质回缩，胞体呈圆球形。,?,10,分钟一,4,小时,?,贴壁期：,?,细胞附着于,底物,上，游离期,结束。细胞株平均在,10,分钟一,4,小时,贴壁。,?,底物,：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等,?,血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白,（,生长基质,），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底,物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。,?,进口塑料培养瓶涂有,生长基质,（化学合成的功能基团）,?,潜伏期,?,此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期,一般为,6,24,小时。,?,对数生长期：,?,细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,?,停止期（平台期）,：,?,细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂,?,机制：接触抑制、密度依赖性,培养细胞生长的条件,?,1,细胞的营养需要,?,2,细胞的生存环境,?,温度,:37,?,O,2,?,CO,2,:5%CO,2,+H,2,O,H,2,CO,3,H,+,+HCO3,-,?,pH:7.2-7.4,?,渗透压,?,3,无污染,?,4,无毒,实验准备,实验用品：,?,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，,酸缸,?,CO,2,培养箱,?,倒置显微镜,?,酶标仪、微孔板震荡器,?,液氮罐,?,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,?,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，,冻存管,?,压力蒸汽消毒器：,湿热消毒，用途广,?,电热干燥箱：,干热消毒（,160,，,2,小时）。主要用干玻璃,?,器皿消毒,?,滤器：,过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、,?,酶液等均采用滤过法除菌,?,超净工作台：,为细胞操作提供无菌环境,?,紫外灯,：,紫外线消毒。,主要用于培养室空气、操作台、塑料,?,培养皿和培养板等表面消毒,超净台,?,?,超净工作台的工作,原理是利用鼓风机,驱动空气遁过高效,滤器除去空气中的,尘埃颗粒，使空气,得到净化。净化空,气徐徐通过工作台,面，使工作台内构,成无菌环境。,滤,器,CO2,培养箱,?,CO2,培养箱设定的条件为,37,，,5,CO,2,。,?,使用,CO2,培养箱培养细胞时应注意的问题：,?,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖,微松，以保证通气。,?,保持培养箱内空气干净。定期消毒,?,（,90,，,14 h),。,?,箱内火菌蒸馏水,3000,毫升蒸馏水槽中,以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器,纯水仪,酶标仪,微孔板震荡器,培,养,板,培养瓶,?,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（,24,小时）、,?,流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、,50,烘干,?,常用玻璃器皿清洗,?,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘,蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离,?,胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。,?,胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无,Ca2+,、,Mg2+,的,PBS,缓冲液配制常,用的胰蛋白酶液浓度是,0.25,。用滤器过滤除菌。,?,胰蛋白酶液消化时间：,2-10,分钟。,?,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,消化液：,培养基,?,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，,分天然培养基和合成培养基。,?,天然培养基,：,?,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,?,优点：营养成分丰富，培养效果好,?,缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验,结果的分析。易发生支原体污染,?,合成培养基,:,?,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，,如,TC199,、,MEM,、,RPMI-1640,、,DMEM,等。,?,合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、,无机盐和其它一些辅助物质。,?,优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低,?,缺点：,缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需,要。,?,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想,使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天,然培养基（如血清）。,?,血清中含有：,?,多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）,?,多种金属离子；,?,激素；,?,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。,?,各种生长因子,?,转移蛋白,?,不明成分,?,一般说来含,5,小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞,不死但支持细胞生长一般需加,10,血清,?,对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的,复杂成分至今尚未完全清楚,?,血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子,或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学,特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,?,在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要,用无血清培养基培养细胞,?,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因,子，如激素、生长因子,、结合蛋白,、贴壁和扩展因子,等。,?,无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。,?,1975,年，,Sato,首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近,20,多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和,增殖。,?,无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和,稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的,程序。,?,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于,某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使,同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。,无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。,目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,?,血清质量好坏是实验成败的关键。,?,常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血,清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。,?,优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、,支原体、病毒污染。,?,血清的灭活（消除补体活性）：,56,，,30,分钟,?,血清的消毒：过滤除菌,?,抗菌素的使用：,?,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制,可能存在的细菌的生长。,?,通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、,链霉素最终使用浓度为每毫升,100,单位。,?,庆大霉素：每毫升,100,单位,方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,?,基础培养基,80,一,95,?,血清,5,一,20,?,碳酸氢钠,2.0 g/L,?,青、链霉素,各,100,卑位毫升,培养基的配制,RPMI-1640,培养粉,1,袋,碳酸氢钠,2.0 g,青、链霉素,各,100,单位毫升,加三蒸水,至,1000ml,过滤除菌。,调节,pH,值至,7.2,加血清（终浓度,10,）,细胞传代方法,?,根据细胞生长的恃点，传代方法有,3,种。,1.,悬浮生长细胞传代,?,离心法传代：离心（,1000,转,/,分,）去上清，沉淀物加新培养液后,再混匀传代。,?,直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除,1/2,一,2/3,，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,2,半悬浮生长细胞传代,（,Hela,细胞）,?,此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法,使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。,3,贴壁生长细胞传代,?,采用酶消化法传代。常用的消化液有,0.25,的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法：,?,1.,吸光培养瓶中的培养液,?,2.,加入,1-2 ml 0.25,的胰蛋白酶液,(,以消化液能覆盖整个瓶底为准）,静置,2-10 min,（显微镜下动态监测）。,?,3.,吸去胰蛋白酶液，加入培养液。,?,4.,用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。,?,5.,吸取,1/10,1/40,细胞悬液，接种于新的培养瓶内。,?,6.,加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。,?,7.,将后者放入培养箱中培养。,细胞计数,?,血细胞计数器：手工计数细胞,?,Coulter,计数仪：人工计数,培养细胞活力测定,?,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段,之一。,?,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，,从形态上区别死、活细胞是困难的。,?,1.,细胞克隆形成率实验：,单个细胞在体外增殖,6,代以上，其后代所组成的细,胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细,胞的增殖能力。,?,克隆形成率比克隆形成数接种细胞数,?,缺点：操作繁琐,?,优点：精确、可靠,?,2.,台盼蓝法,?,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占,细胞中的百分比表示细胞恬力,?,已淘汰,?,3.,四唑盐（,MTT,）比色法,四唑盐（,MTT,）商品名为噻唑蓝，,?,四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干,水的蓝紫色产物（,formazan),，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这,种功能。二甲亚砜（,DMSO,）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，,溶液颜色深浅与所含的,formazan,量成正比。再用酶标仪测定,OD,值,?,MTT,法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、,肿瘤放射敏感性实验等。,?,操作步骤,?,（,1,）单细胞悬液接种于,96,孔培养板；,10,3,-10,4,细胞,/,孔，每孔培养,基总量,200,微升（,96,孔培养板每孔容积,370,微升），,37,、,5,?,CO,2,培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）,?,（,2,）加入,2,毫克毫升的,MTT,液（,50,微升孔）；继续培养,3,小,时。,?,（,3,）吸出孔内培养液后，加入,DMSO,液（,150,微升孔），将培,养板置于微孔板扳荡器上振荡,10,分钟，使结晶物溶解。,?,（,4,）酶标仪检测各孔,OD,值（检测波长,570,纳米）。记录结果，,绘制,什么时候传代？,细胞消化的最佳程度,细胞冻存和复苏,?,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。,细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少,入力、经费，减少污染，减少细胞生物,学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,?,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱,水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰,晶。,?,?,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生,大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、,纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止,小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,?,标准程序：,?,当温度在,-25,以上时，,1,2,/min,?,当温度达,-25,以下时，,5,10,/min,?,当温度达,-100,时，可迅速放入液氮中,?,细胞冻存器,?,简易程序：,?,将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，,通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降,1,2,的速度，在,40,分钟内降至液氮表面，停,30,分钟后，直接投人液氮,中。,低温保护剂的应用,?,在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提,高冻存效果。,?,常用的低温保护剂是,DMSO,，它是一种渗,透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞,膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结,过程，能使细胞内水分在冻结前透出细,胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，,从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,?,1,预先配制冻存液：,含,20%,血清培养基,10%,DMSO,?,2,取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适,量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液,（,1,10,6,5,10,6,细胞,/ml),?,3,加入,1ml,细胞于冻存管中，密封后标记冷冻,细胞名称和冷冻日期。,?,4,年后，存洁率可达,80,一叽。,DMSO,液用,培养液配好，,?,避免因临时配制产热而伤害细胞。对人造血干,细胞的研究证,细胞复苏方法,?,（,l,）从液氮中取出冷冻管，迅速投入,37,38,水浴中，使其融化（,1,分钟左,右）。,?,（,2,）,5,分钟内用培养液稀释至原体积的,10,倍以上。,?,（,3,）低速离心,10,分钟。,?,（,4,）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏,的细胞。,