细胞实验基本操作与实验室要求课件.ppt

精选PPT,1,第三章 细胞工程实验室及实验基本操作,精选PPT,2,第一节 实验室及仪器设备 第二节 实验基本操作 第三节 培养基及其配制,精选PPT,3,第一节 实验室及仪器设备,细胞工程实验室要能满足清洗、无菌操作、培养基制备、贮藏和培养鉴定等多方面的要求。,精选PPT,4,1、植物实验室,基本操作室,无菌操作室,培养室,鉴定分析室,温 室,一、实验室,精选PPT,5,2、动物细胞培养室原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无尘。实验室设置上至少有4个房间：基本操作室，洗涤，灭菌。缓冲间，位于准备室和培养室之间。无菌培养室，内有超净工作台，一般应在内侧，室内可消毒，培养箱。鉴定分析室，用于细胞的观察和分析研究。,精选PPT,6,二、实验室仪器设备,（一）必要器皿1、培养器皿（动物细胞培养一般为塑料器皿，优点是一次性使用，已消毒灭菌密封包装，打开即可用；植物细胞培养一般用三角瓶）2、盛装器皿（各种玻璃器皿）3、计量器皿（量筒、吸管、加样器等）4、金属器皿（用于解剖、取材、剪切组织等）,精选PPT,7,精选PPT,8,精选PPT,9,（二）常用仪器设备1无菌操作仪器设备 医用超净工作台(气流水平型和垂直型)，高压蒸汽灭菌锅(手提式、立式)，干热灭菌烘箱，过滤除菌装置。2培养仪器设备 植物：培养架、摇床、振荡式培养机(100次/min)、恒温恒湿光照培养箱、暗培养箱等。动物：恒温培养箱及CO2恒温培养箱。,精选PPT,10,3药品存贮和配制仪器设备4观察分析仪器设备 显微镜（高倍、倒置、实体解剖和荧光显微镜等）及配套照相系统、解剖镜、离心机、液氮容器、恒温箱、精密天平等。5其它仪器设备，如流式细胞仪，酶标仪等。,精选PPT,11,精选PPT,12,精选PPT,13,二氧化碳细胞培养箱,精选PPT,14,精选PPT,15,精选PPT,16,精选PPT,17,MB-IV 型 酶 标 检 测 仪,精选PPT,18,精选PPT,19,精选PPT,20,精选PPT,21,第二节 实验室的基本操作,实验室的基本操作是围绕无菌要求进行的，主要包括清洗、消毒灭菌，无菌操作等。,精选PPT,22,一、清洗未用过的玻璃器皿：常有游离碱性物质，使用前，先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用洗衣粉洗涤，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，晾干备用。已用过的玻璃器皿：用洗衣粉刷洗，清水冲洗，晾干备用。新的塑料器皿：打开即用。已用过的塑料器皿金属器皿：一般不宜用洗涤液洗涤，新的用热洗衣粉水洗净、冲洗后，蒸馏水冲洗擦干即可。,精选PPT,23,细胞培养的玻璃器皿常需用洗液浸泡，再拿出冲洗，洗液配方如下：,精选PPT,24,1、KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。以防暴沸。2、浓硫酸要慢慢倒入KCrO4液中。3、洗液要密封保存，以免失效。正常洗液黑棕色 蓝绿色（效用变弱）,精选PPT,25,二、消毒灭菌,严格的消毒灭菌起着至关重要的作用，主要物理灭菌方法有：湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水121，1.0-1.1 Kg/cm2，20-30分钟 干热灭菌：烤箱、焚烧、酒精灯,于150恒温40 min,或120恒温2h，或160恒温1.5-2h(芽孢杆菌)射线照射灭菌：紫外线(细胞培养室，超净工作台)、电离辐射 过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器 0.22-0.45m,精选PPT,26,高温高压灭菌可能出现的问题：pH值下降0.3-0.5太高温度灭菌时可能使糖焦化，可能产生毒性，对有些培养基应选择合适条件灭菌。灭菌时间过长使盐沉淀，同时使琼脂解聚挥发性物质不能高温灭菌，否则会被破坏,精选PPT,27,精选PPT,28,化学消毒灭菌主要有：熏蒸灭菌药物蒸汽对室内空气进行杀菌。甲醛和高锰酸钾混合后产生大量蒸汽。醋烧开。化学药品灭菌70%-75%酒精，升汞漂白粉新洁尔敏过氧化氢抗生素抑菌法 青霉素、链霉素、新霉素,精选PPT,29,常用消毒剂消毒灭菌效果比较表,精选PPT,30,三、无 菌 操 作,1、无菌操作前的准备工作：穿好工作服、戴上工作帽和口罩。将各种操作所用的金属器械浸泡在95或70的酒精，点燃酒精灯。将耐热器皿（不锈钢小盘）中加入少量酒精，将蘸有酒精的金属器械及器械支架放入耐热器皿中灼烧，待凉后备用。用7075的酒精擦拭新培养容器和继代培养容器表面，放置超净台上待用。用上述浓度的酒精擦拭双手和前臂。,精选PPT,31,精选PPT,32,精选PPT,33,2、无菌操作步骤 将培养材料灭菌后放入已消毒的培养皿中，置于超净工作台酒精灯火焰下方，进行适当切割或其他处理。在酒精灯火焰处将培养瓶盖轻轻打开，瓶口在火焰处旋转灼烧。将镊子过火，用镊子将培养材料置于培养基上 将镊子、瓶口及塞子过火后盖回瓶口。继代培养用灭菌的器具（镊子或吸管）直接将培养材料放置在新培养基上。,精选PPT,34,第三节 培养基及其配制,精选PPT,35,定义：培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。,没有任何一种培养基能够适合一切类型的组织、细胞和器官的培养。,精选PPT,36,必要元素在细胞内的主要生理作用,组成各种化合物，参与有机体的构造，成为结构物质。构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的生理代谢。元素间互相协调，维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用。调节形态发生和组织器官的建成。,精选PPT,37,一、植物细胞培养基及其配制,完善的植物培养基配方为：水分 无机营养成分 有机营养成分 生长调节物质 琼脂,精选PPT,38,精选PPT,39,（一）培养基成分1、无机元素氮-各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成成分。钙-细胞壁的成分之一铁、锌、钼-某些酶的组成成分植物缺乏无机元素可能引起的疾病：植物失绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等。营养元素过多可以引起植物细胞代谢障碍、生长抑制。,精选PPT,40,2、有机营养成分,提供促进培养细胞生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质，包括：氨基酸类 维生素类 糖类 天然有机添加物类,精选PPT,41,氨基酸类,常用：甘氨酸有时用：丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白等。用量通常为2-3mg/L。水解酪蛋白CH和水解乳蛋白LH，对培养材料的细胞分化有良好的促进作用，用量为100-2 000mg/L,精选PPT,42,维生素类,维生素类是以辅酶形式参与植物细胞代谢活动的重要物质，对生长、分化有很好的促进作用。用量：0.1-10mg/L 常用：盐酸硫胺素（维生素B1）盐酸吡哆醇（维生素B6）烟酸（维生素B3）叶酸（维生素Bc）有时用：生物素（维生素H）泛酸钙（维生素B5）抗坏血酸（维生素C）,精选PPT,43,糖类,糖类是培养基的主要碳源。常用碳源是蔗糖，还有葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖、山梨糖等。适宜的浓度为2%-5%。离体双子叶植物根：以蔗糖为碳源最好。单子叶植物的根：以右旋糖（葡萄糖）为碳源最好。,精选PPT,44,肌 醇,在糖类的互相转化中起作用，是培养基中不可缺少的有机营养。形成细胞壁的构建物质：果胶质。形成植酸 与Ca2+、Mg2+结合成植酸钙镁。形成磷脂，细胞膜组分。可见肌醇参与了碳水化合物、磷脂代谢和离子平衡等生理活动。用量为50-100mg/L。,精选PPT,45,天然有机添加物类,椰乳、马铃薯汁、酵母提取液、番茄汁等。化学成分不明的复杂营养混合物，对细胞和组织的生长和分化有明显的促进作用，但质和量受多种因素影响，实验的可重复性差。,精选PPT,46,生长调节物质,是促进培养植物生长良好的主要因素。由无机和有机营养构成的培养基仅保证了培养物的生存，只有配以适当的植物生长调节物质时，才能诱导细胞分裂的启动，愈伤组织生长及根、芽分化和胚状体的发育。,精选PPT,47,植物生长调节物质包括：生长素（auxin）类 细胞分裂素类（cytokinin）赤霉素（gibberellin）类 脱落酸（abscisic acid）乙烯（ethylene）等,精选PPT,48,生长素类,组织培养中生长素的作用：促进细胞伸长生长和细胞分裂 诱导愈伤组织形成 促进生根 诱导不定芽的分化（与细胞分裂素配合）诱导侧芽的萌发与生长 胚状体的产生等,精选PPT,49,精选PPT,50,常用生长素有：2,4-二氯苯氧乙酸：有抑制芽形成的副作用，一般用于启动细胞的脱分化。诱导分化则用NAA或IBA、IAA。萘乙酸（NAA）吲哚丁酸（IBA）：人工合成，120C仍很 稳定。组织培养中常用。生根效果好。吲哚乙酸（IAA）等：天然植物生长素，见光易分解，高温高压易破坏。,精选PPT,51,细胞分裂素类,细胞分裂素的作用：促进细胞分裂 诱导愈伤组织或器官分化不定芽 抑制顶端优势而促进茎的增殖 抑制离体组织或器官衰老等,精选PPT,52,精选PPT,53,常用的细胞分裂素有：激动素或糖基腺嘌呤（kinetin，KT）（见光易分解，需暗处保存）6-苄基腺嘌呤（6-BA）2-异戊烯腺嘌呤（2-Zip）玉米素（zeatin，ZT）等,精选PPT,54,赤霉素类,赤霉素（gibberellin，GA）有20多种。组织培养中仅使用GA3一种：能促进诱导形成的不定胚正常发育成小植株。GA3不耐热，溶水后不稳定，需溶于酒精中，过滤除菌。,精选PPT,55,脱落酸,脱落酸（abscisic acid，ABA）的作用：抑制蛋白质合成 抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用 诱导休眠 促进衰老和脱落 抑制气孔开放，减少蒸腾作用 对一些培养物芽的形成有促进作用,精选PPT,56,短日照条件诱导脱落酸合成，延缓生长、促进落叶、形成休眠芽（秋季）。长日照条件诱导赤霉素合成，促进生长、诱导开花（春夏季）。,精选PPT,57,乙烯,乙烯的作用：具有促熟果实 促进脱落和衰老 促进橡胶、漆、松脂等次生物质的排泌 促进菠萝开花 增加黄瓜等雌花数量等,精选PPT,58,培养时植物组织自身会散发出乙烯。生长素用量过高时会诱导植物产生乙烯。较高的乙烯引起植物发生形态变化：豌豆上胚轴加粗、失去负向地性等。用高锰酸钾进行吸附可减少乙烯含量。常用乙烯利（2-氯乙基膦酸）：在pH值高于4.1时，即分解释放出乙烯。,精选PPT,59,琼 脂,固体培养基最好的固化剂是琼脂。是从海藻中提取的一种高分子多糖类物质，不提供任何营养成分，培养材料良好的支持物。用量为3-10g/L。溶于热水，在40C以下凝固为凝胶状。琼脂能吸附细胞代谢中的一些废物。,精选PPT,60,在研究组织或细胞营养代谢时，应避免使用琼脂培养基，因为杂质会影响研究结果。液体培养基中用无灰滤纸制成的纸桥作为支持物来培养愈伤组织，避免了琼脂杂质的影响。,精选PPT,61,植物组织培养中常用的琼脂的化学成分,精选PPT,62,植物培养基的pH值,植物培养材料大多要求弱酸性的环境。灭菌前需将pH值调节到5.6-5.8。当pH高于6时，培养基变硬，不利于培养物的生长。而低于5时，琼脂不能很好凝固。,精选PPT,63,各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。据无机盐的含量可分为：高无机盐含量培养基 硝酸钾含量较高培养基 中等无机盐含量培养基 低无机盐含量培养基应用最为广泛的培养基：MS。,精选PPT,64,1、高无机盐含量培养基,主要有MS和ER培养基。特点：钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高。微量元素种类齐全。养分数量及比例比较合适广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。,精选PPT,65,2、较高硝酸钾含量培养基,主要有B5和N6培养基。适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。,精选PPT,66,3、中等无机盐含量培养基,主要有Nitsch和NT培养基。特点：大量元素约为MS培养基的一半。微量元素种类减少，但含量较MS高。适合于花药培养。,精选PPT,67,4、低无机盐含量培养基,主要有White 和Heller。特点：培养基大量元素含量大幅降低和种类减少。多数用于生根培养基。,精选PPT,68,（二）植物培养基配制,母液的配制和培养基的配制1母液的配制 母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合45C保存。配制好的母液种类一般有：大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。,精选PPT,69,1、培养基母液的配制,大量元素母液：10100倍浓度。微量元素和有机营养母液：100倍浓度。混合定容：注意药剂的添加次序及稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐：分别单独配制。生长调节类物质：0.21.0mg/ml原液。IAA等醇溶性，先用少量95%酒精溶解，再用dH2O定容。KT、6-BA、2-Zip、ZT：先溶于少量1mol/L盐酸，再用dH2O定容。叶酸：先用少量稀氨水溶解后再定容。,精选PPT,70,培养基的配制方法,在干净容器中加入终体积约3/4的dH2O及所需要的琼脂和糖，煮沸溶解琼脂。不时搅拌以防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出。加入所需量的各种母液及生长调节物质（不包括过滤除菌药剂）。加dH2O至近终体积，再次煮沸并加dH2O至终体积。充分混合后用1N盐酸或1N氢氧化钠调节pH值。冷却，加入过滤除菌药剂，分装，50ml培养基/150ml三角瓶，封口。高压灭菌，室温凝固备用。,精选PPT,71,水药品糖 混合 pH调整 加热溶解琼脂玻璃器皿 水洗 干燥 分装 加塞 高压蒸气灭菌 植物培养基配制程序,冷却,精选PPT,72,需加入过滤灭菌的药品，在高压灭菌后，培养基凝固前加入，并轻摇使混匀。培养基终体积定容时，可以利用台秤通过重量进行培养基终体积的确定。,精选PPT,73,培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且会影响到琼脂的凝固。经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低0.2），调pH值时应考虑。,精选PPT,74,二、动物培养基,动物细胞的营养要求比植物细胞的要复杂得多。目前，绝大多数动物细胞必须在培养基中添加血清等成分不明确的天然培养基成分，还不能在成分完全明确的培养基中生长繁殖。,精选PPT,75,动物细胞培养基通常是液态。根据其是否能促进细胞生长，可分为：生长培养基（growth medium）维持培养基（maintenance medium）按来源，又可分为：合成培养基 天然培养基。,精选PPT,76,生长培养基,生长培养基是指用来培养细胞使其快速生长增殖的培养基。对动物细胞来说，一般只要将生长培养基中的血清浓度降低或全部除去，就可获得维持培养基。,精选PPT,77,维持培养基,维持培养基是指只能用来维持培养细胞的存活，但不能促使细胞生长和增殖的培养基。培养细胞处于不分裂状态下，更易分泌活性产物此时，若加入特定化学药品，可诱导细胞产生活性产物；若细胞感染了病毒，则在此状态下病毒会大量扩增，从而生产病毒疫苗。,精选PPT,78,特点：能在数周内使培养细胞保持良好状态，而不会使细胞的特性受到损害。目的：提高细胞的生产力，细胞不生长，能更多更快生产终产物。维持培养基成分可能很复杂，也可能很简单。,精选PPT,79,条件培养基,在培养过程中，有些细胞可能会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后，含有细胞分泌物的培养液又称为条件培养基(conditioned medium）。,精选PPT,80,天然培养基和合成培养基,天然培养基主要包括:各种动物的体液（血淋巴、血浆和血清）、组织提取液（胎汁、酵母提取物）等合成培养基是指按照体内细胞所需营养的种类和数量配成的成分明确的培养基。一般来说，合成培养基只能维持动物细胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基。,精选PPT,81,(一)培养基的成分,1、生长培养基培养动物细胞用的生长培养基组分包括9种：水、无机盐、微量元素、维生素、缓冲系统、能源和碳源、氮源、激素和生长因子、添加剂等,精选PPT,82,水,对水的要求极其严格水是细胞的主要组成成分之一，水在细胞内主要起溶剂作用。细胞吸收的营养物质、分泌的产物、代谢的废物都要溶解在水中；细胞内的化学反应、细胞的运动及维持细胞内外的渗透压也离不开水。水是离体培养细胞的重要生存环境。,精选PPT,83,无机盐（大量元素）,解决培养细胞短期生存问题，重要的因素是渗透压。用于培养细胞的培养基的渗透压必须接近或等于细胞本身的渗透压，即等渗溶液。否则细胞就会失水皱缩或吸水膨胀而死亡。等渗溶液主要是通过培养基内无机盐中的各种离子来实现的。,精选PPT,84,配制动物细胞培养基的无机盐与植物细胞的很不相同NH4+对动物细胞是有毒的，但它却是植物细胞必需的氮源；KCl和NaCl在动物细胞培养基中含量都较高，但它们对植物细胞的生长却似乎并不重要。动物细胞以高氧化态的Fe3+（硝酸铁）为铁源，而植物细胞以Fe2+（硫酸亚铁）为铁源。,精选PPT,85,微量元素,缺乏稀有微量元素的培养基对任何真核细胞的培养都是不合适的。培养基中微量元素的含量通常都很低，一般小于1g/L，水和无机盐中已有足够量，不需要另加。,精选PPT,86,维生素,动物细胞培养也需要维生素，而且动物细胞对维生素种类的要求通常比植物细胞要多一些。,精选PPT,87,动植物细胞培养基中常用的维生素,维生素,精选PPT,88,缓冲系统,缓冲系统对维持培养基的pH值是至关重要的。动物细胞培养基的pH值是通过模拟血浆内天然存在的CO2/NaHCO3系统来控制的。,精选PPT,89,缓冲系统,肺中:空气中O2扩散到血液中，并与血红细胞结合。血浆中CO2扩散到空气中，被排出体外。组织中：血红细胞释放携带的O2并扩散到组织细胞中，组织细胞呼吸产生的CO2被排放到血浆中。血浆中CO2的溶解与释放与形成H2CO3有关。,精选PPT,90,NaHCO3作为等渗溶液的一部分加到培养基内。临配制前加入，约2g/L在密闭式培养瓶内，一方面，由于NaHCO3不稳定，易分解产生CO2，CO2从培养液中游离出来，使培养液pH值升高；另一方面，细胞呼吸产生的CO2，以及细胞代谢产生的酸性代谢产物，又使培养液pH值降低。,精选PPT,91,培养基颜色的变化,在培养开始的时候，培养基的pH值可能会明显上升，但随着细胞的生长和细胞数目的增多，培养基的pH值就会逐渐降低。酚红作为pH指示剂：培养基的颜色变化是：樱桃红色 粉红色 黄色。,精选PPT,92,在使用培养基之前，先通入CO2；或在CO2培养箱内，开放式培养的话培养基的颜色变化则是：樱桃红色 黄色,精选PPT,93,pH,动物细胞对pH的稳定性要求较高，6.8-7.6。植物细胞则要求不高。一般通过改变培养基中的磷酸盐或碳酸盐的比例来达到一定的pH值。,精选PPT,94,能源和碳源,葡萄糖(1-4g/L)是动物细胞的主要碳源。丙酮酸、琥珀酸和肌酸等碳源也常常成为动物细胞的补充能源。当不要求培养细胞以最大速度生长时，可以用半乳糖代替葡萄糖。,精选PPT,95,能源和碳源,植物细胞的能源包括蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和淀粉。蔗糖不能直接穿过细胞壁进入细胞内被利用，但植物的细胞壁内含有蔗糖酶（invertase），它能把蔗糖水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖再穿膜进入细胞内被利用。,精选PPT,96,氮 源,动物细胞合成蛋白质和核酸的氮源有两种：成分明确的氮源 指动物细胞合成蛋白质和生长所必不可少的一些必需氨基酸和非必需氨基酸。成分不明确的氮源 指动物细胞培养基中加入的各种动物血清、组织提取液以及蛋白水解产物（如水解乳蛋白）等。,精选PPT,97,血清（serum）,血清是大多数生长培养基的一个成分。最常用的是牛血清，但马、人、兔及其他来源的血清有时也用。一般来讲，动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长。所以成年牛血清不如小牛血清，小牛血清不如胎牛血清（fetal bovine serum）。,精选PPT,98,血清（serum）,血清中已知的贴壁和铺展因子有：纤粘蛋白（fibronectin）冷不溶球蛋白（cold-insoluble globulin，CIG）血清铺展因子（serum spreading factor，SSF）胎球蛋白,精选PPT,99,目前尚不充分了解。血清中含有多种细胞生长和增殖所必不可少的激素、生长因子以及贴壁和铺展因子，其作用：血清和蛋白水解产物为培养细胞提供氮源。具有促进细胞生长的能力。具有促进细胞在培养基质上附着和铺开的能力。抑制蛋白质水解酶活性的能力。,精选PPT,100,血清对蛋白质水解酶活性的抑制作用：可以保护体外培养细胞不受死细胞所释放的蛋白酶的伤害，抑制传代时所用胰蛋白酶的消化作用，简化传代过程。,精选PPT,101,血清对培养细胞的不良影响,A、血清中存在一些不利于细胞生长和繁殖的物质，如补体、免疫球蛋白、病毒、支原体和一些生长抑制因子等；B、血清的成分不明确，影响对结果的分析；C、不同动物、不同批次血清的成分和活性差异较大，使培养结果不稳定，实验重复性差。血清的灭活处理（灭活补体成分）：血清解冻后，于56水浴30min。灭活后的血清其促生长能力有所减弱，但可以在4保存很长时间。,精选PPT,102,激素和生长因子,激素和生长因子都是培养动物细胞生长和增殖必不可少的物质。二者的功能有时很难严格区分。,精选PPT,103,添加剂,微生物污染是细胞培养失败的一个重要原因，因此培养基中常常要加入一定量的抗生素，减少污染的机会。但是需要注意的是，抗生素只能抑制而不能消灭微生物，因而对于已建立的细胞系，应尽量少用或经常停用抗生素，以便使可能的低度微生物污染及时得到暴露。,精选PPT,104,（二）培养基的制备,1、天然培养基 血清水解乳蛋白胚胎浸出液（胎汁）胶原,精选PPT,105,血清,基本制备过程：无菌条件下取血，然后将盛血的小瓶或试管倾斜，室温放置2-4h，待血液充分凝结后，移入4冰箱过夜，让血清析出。次日，吸取析出的血清（淡黄色），4000 rpm离心10 min，收集上清液，过滤除菌后分装保存于-20。自制血清应进行质量检测，保证无细菌、真菌、支原体和病毒污染，且球蛋白含量不超过0.2g/L。若球蛋白含量过高，表明胎牛或孕牛患有感染性疾病。因此，球蛋白含量越低的血清，其质量越好。,精选PPT,106,水解乳蛋白LH,水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解后的产物，含有丰富的氨基酸。可用于许多细胞系和原代细胞的培养，是常用的天然培养基。使用时，用Hanks液配制成0.5%的酸性溶液，然后与合成培养基以一定比例混合使用（一般为1:1的体积比）。商品化的水解乳蛋白为淡黄色粉末，易潮解结块，但不影响使用。不同商家和不同批次的水解乳蛋白质量有所差异。,精选PPT,107,胚胎提取液,是早期细胞培养中应用的天然培养基。主要成分是一些大分子蛋白和小分子氨基酸，能促进细胞生长繁殖。常用鸡胚浸出液和牛胚浸出液。鸡胚浸出液的制备方法是：将9-10d胎龄的鸡胚磨碎，加等量缓冲液，离心收集上清，保存于-20。,精选PPT,108,胶原（collagen）,作用：为了促进组织块或细胞的贴壁生长能力。来源：大鼠尾腱、豚鼠和牛的真皮以及牛眼的水晶体等。实验室大鼠尾腱制备方法：无菌条件下，取大鼠的尾腱，剪碎，用0.1%醋酸溶液4浸泡48 h后，4000 r/min 离心30 min，取上清分装保存于-20。使用：将胶原均匀涂布于培养瓶的细胞生长面上，然后用沾有氨水的消毒棉球塞住瓶口，置密闭容器中室温作用2 h，氨气与胶原作用，使胶原凝固。然后用平衡盐溶液洗涤胶原面，再经细胞培养液浸泡过夜，37干燥备用。,精选PPT,109,2、合成培养基,第一个合成培养基是由Lewis于1911年设计的，仅含有几种盐类和糖类。合成培养基一般只能短期维持细胞生存，必须补加血清后才能作为生长培养基。常用合成培养基：MEM、DMEM、DMEM/F12、Hams F12、RPMI-1640、M199、TC199等。,精选PPT,110,培养基的配制,商品化培养基，粉末状的。方法：每袋培养基粉末溶入1升三蒸水中。然后加入2g左右的NaHCO3粉末，及一定量的抗生素或抗真菌药。充分溶解后，将培养基用孔径0.22m的微孔滤膜抽滤灭菌。分装保存于4或-20。临用前加入10%20%的血清，即可用于动物细胞的体外培养。,精选PPT,111,3、无血清培养基,1911年，Lewis等最早提出。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,精选PPT,112,无血清培养基是否成功：a、细胞至少要在该培养基上经过连续三代测试，使细胞内原先贮存的生长因子已经用完，此后，若细胞还能生长，则说明培养基是适合细胞生长的。b、原先是异源群体（heterogeneous population）的细胞系，经过在成分明确的培养基中适应选择后，细胞类型可能会变得较为单一。c、一般来说，转化程度较高的细胞更容易在成分明确的培养基中生长。,精选PPT,113,实质上就是研制可以替代血清的成分明确的补充成分。补充成分是可以代替血清的各种因子的总称。已有100多种此类因子。按功能可分为四类：激素和生长因子结合蛋白贴壁和扩展因子微量元素和低分子量营养成分。,精选PPT,114,无血清培养基的补充成分(程宝鸾,2000),精选PPT,115,4、平衡盐溶液,两种常用的平衡盐缓冲液：Hanks液和Earl液。二者的主要区别是缓冲能力不同。Hanks液的NaHCO3含量为0.35g/L,缓冲能力低；Earl液的NaHCO3含量为2.2g/L，缓冲能力强。,精选PPT,116,几种常用平衡盐溶液的配方(g/L),精选PPT,117,（三）培养基的选择,培养基的选择基本上凭经验。已建成的细胞系，有特定的培养基。当建立新系时，需参考文献，并比较确定最适培养基。一般来说，原代培养培养基中要含有高分子量蛋白、激素和生长因子，而已建成的细胞系（转化细胞）培养对此要求则不甚严格。原代培养：哺乳动物-水解乳白蛋白加10%血清。HamF10培养基加10%血清。细胞系培养：Eagles MEM和Dulbeccos DMEM。,精选PPT,118,（四）其它常用液,分离细胞的消化液中止酶消化作用的消化酶抑制剂调整培养液酸碱度的pH调整液防止微生物污染的抗生素液,精选PPT,119,1、消化液,胰蛋白酶溶液（trypsin solution）特点：淡黄色粉末，易潮解，存放于冷暗干燥处。主要作用：水解细胞间蛋白质，使细胞离散。,精选PPT,120,胰蛋白酶,有粗制品和精制品两种，多用粗制品。胰蛋白酶的活力是用水解酪蛋白的能力来表示的。常用1:125和1:250两种。表示1份胰蛋白酶能分别解离125份和250份酪蛋白。Ca2+和Mg2+的存在可抑制其活性，一定要用无Ca2+和Mg2+的缓冲液来配制。血清也抑制胰蛋白酶的活性。残留微量胰蛋白酶对细胞无影响。,精选PPT,121,胰蛋白酶的消化作用,影响因素：pH值、温度、组织块的大小和硬度、酶浓度和消化时间等。哺乳动物细胞：37，消化2030 min。常用浓度为0.250.5%，pH值89，消化液的量为被消化物的510倍。消化浓度不能过高，时间不能过长，否则细胞会受损伤。反之，消化不足又达不到分散细胞的目的。因此，胰蛋白酶用于不同原代培养组织块的最适消化条件需摸索后才能确定。,精选PPT,122,胶原酶溶液（collagenase）,来源：芽孢杆菌，消化胶原成分的酶。适用范围：适于消化纤维性组织和癌组织等。类型：胶原酶、和肝细胞专用胶原酶等。活性不受Ca2+和Mg2+抑制，也不受血清抑制。对细胞的作用较胰蛋白酶要温和一些，可处理较长时间。,精选PPT,123,EDTA溶液,非酶性消化液。作用机理：二价阳离子螯合剂，把细胞间游离的Ca2+和Mg2+螯合掉，从而促进细胞脱壁或相互分开。Ca2+和Mg2+：促进细胞贴壁、细胞凝聚和维持组织完整性。作用比胰蛋白酶温和，常与胰蛋白酶合用。使用浓度：0.02%。不受血清抑制。,精选PPT,124,2、消化酶的抑制剂,无血清培养时使用。保护细胞免受残留的消化酶的损害。常用：大豆胰酶抑制剂。使用浓度：0.1-0.5%。,精选PPT,125,3、pH调整液,NaHCO3易分解而释放CO2，导致培养液pH值偏高；当加入血清后，培养液有时会偏酸。常用：3-8%的NaHCO3 10%的醋酸 1N HCl 1N NaOH HEPES,精选PPT,126,4、抗生素溶液,培养液中常加入双抗，即青霉素和链霉素联用，来防治低度细菌污染。两性霉素B和制霉菌素可抑制真菌污染。其它抗生素多在双抗不能控制污染时才使用。,精选PPT,127,组织培养中常用抗生素,精选PPT,128,Thank You!,精选PPT,129,谈谈你对血清在动物培养基中的作用的认识,