第二章电化学传感器的构成课件.ppt

第二章,电化学传感器,1,第一节,电化学传感器概述,一、传感器基本概念,传感器,：能感受（或响应）一种,信息,并变换,成可测量信号的器件。,2,物理信息：光、声、温度、压力等,物理传感器,化学信息：组分、气味、味道等,化学传感器,化学传感器的检测对象：化学物质，要求,对特定分子有选择性的响应。,化学传感器依据其工作原理可以分为：,电,化学式,、光学式、热学式及质量式等。,3,二、电化学传感器工作原理,电化学传感器：由一个或多个能产生与被,测组分某种化学性质相关电信号的敏感元件所,构成的传感器。,根据检测对象的不同可以分为：,离子传感,器、气体传感器、生物传感器,根据工作方式的不同，可以分为,电位型,传感器、,电流型,传感器、,电导型,传感器,4,电化学传感器总工作原理：将被测物与敏,感材料之间相互作用产生的化学信息转换,成可测量的电信号。,选,择,性,敏,感,膜,二,次,仪,表,换,能,被分析物,化学信息,电信号,器,5,1,、电位型传感器工作原理,离子选择性膜中,的离子与溶液中的离,子发生交换反应，在,两个界面处形成两个,液接电位。,膜,电位,与溶液中待测离子活度（或浓度）,的对数值呈线性关系,。,电位型传感器中，研究最多的是,离子传感,器,，或称,离子选择性电极,。,6,2,、电流型传感器工作原理,通过测量,电流,或电,量来测定化学量,通常采用,三电极体,系,：工作电极、辅,助电极、参比电极,测量的电流信号与发生电极氧化（或还原）的,物质浓度相关,。,7,3,、电导型传感器工作原理,通过测量,电导,来测,定化学量,惠斯顿电桥平衡法,R,1,R,x,?,?,R,3,R,2,电导型传感器有极高的灵敏度，但几乎,没有,选择性,，因此应用较少。,8,三、电化学传感器的性能指标,电化学传感器的性能指标：,灵敏度,、,选,择性,、,响应时间,、准确性、测量范围、温度,系数、,背景电流和仪器噪声,、稳定性、使用,寿命等。,各性能指标与敏感元件的本性、电极材,料、制备工艺、信号收集与处理系统的性能,等因素有关。,9,1,、灵敏度,影响灵敏度的因素：,(1),待测物在检测系统中的传质速度；,(2),电极材料的电化学活性（包括电极材料、,电极的物理形状和工作时的电极电势）；,(3),反应过程中每摩尔物质传递的电流；,(4),待测物在电解液中的溶解性和流动性；,(5),传感器的几何形状和样品进入的方法；,(6),膜电位的大小及达到平衡的时间长短；,(7),工作电极产生的噪声信号大小。,10,2,、选择性,?,对电位型传感器而言，选择性依赖于被测,溶液和参比溶液之间膜电位的大小，膜电位,要迅速达到平衡，只对所研究的离子有响应,并随浓度线性变化；,?,对电流型传感器，工作时的电极电势和电,催化剂的选择直接影响传感器的选择性。,选择合适的电解液和操作方法、加过滤,器或选择渗透膜可提高传感器的选择性。,11,3,、响应时间,?,对电位型传感器，响应时间取决于膜电,位达到平衡的时间长短；,?,电流型传感器的响应时间在很大程度上,取决于反应电阻和界面电容的时间常数。,4,、背景电流和仪器噪声,背景电流与仪器噪声影响传感器灵敏度。,背景电流产生原因：电解液或电极上的,杂质；电极的腐蚀；反应物或对电极上的,反应产物的扩散。,12,第二节,离子传感器,离子传感器又称离子选择性电极，它是,由敏感膜、内导体系、电极控件等部件组成，,它能与溶液中某种特定的离子产生选择性的,响应,。,响应,是指离子选择性电极,敏感膜,在溶液,中与特定离子接触后产生的膜电位值随溶液,中该离子的浓度变化而变化。,13,一、离子传感器的基本结构,玻璃,电极,离子接触型,全固态型,硫化银膜电极,将离子选择性电极与参比电极组成一个原,电池，在零电流条件下测量原电池电动势，通,过能斯特方程计算溶液中待测离子的活度。,14,二、离子传感器的分类,根据膜电极响应机理，膜的结构、组分对离子,传感器分类：,晶体膜传感器,均相膜传感器,非均相膜传感器,基本传感器,非晶体膜传感器,硬质传感器,（玻璃电极）,带正电荷载体,流动载体传感器,带负电荷载体,带中性载体,场效应半导体传感器,敏化传感器,气敏传感器,生物敏传感器,15,1,、晶体膜传感器,敏感膜是由难溶盐经过加压或拉制，制,成单晶、多晶或混晶的活性膜。分为均相和,非均相晶体膜两类。,?,均相膜：由一种纯固体材料单晶或单种化,合物或集中化合物均匀混合压片制成的膜。,?,非均相膜：除了晶体敏感物外，还加入了,高混合惰性载体，如聚氯乙烯、硅橡胶、石,蜡等，以改善膜传感性能。,16,晶体膜传感器的品种和性能,传感器,F,Cl,Br,I,CN,Ag,S,2,Cu,2,Pb,2,Cd,2,膜材料,LaF,3,Eu,2,AgCl,Ag,2,S,AgBr,Ag,2,S,AgI,Ag,2,S,AgI,Ag,2,S,CuS,Ag,2,S,PbS,Ag,2,S,CdS,Ag,2,S,线性响应浓度范围,c/(mol,?,L,1,),5,?,10,7,1,?,10,1,5,?,10,5,1,?,10,1,5,?,10,6,1,?,10,1,1,?,10,7,1,?,10,1,1,?,10,6,1,?,10,2,1,?,10,7,1,?,10,1,5,?,10,7,1,?,10,1,5,?,10,7,1,?,10,1,5,?,10,7,1,?,10,1,OH,主要干扰离子,Br,S,2,O,3,2,I,CN,S,2,S,2,O,3,2,I,CN,S,2,S,2,I,Hg,2,Ag,Hg,2,Fe,3,Cl,Cd,2,Ag,Hg,2,Cu,2,Fe,3,Cl,Pb,2,Ag,Hg,2,Cu,2,Fe,3,17,晶体膜电极由电极管、内参比电极、内充液,和敏感膜四部分组成。,三种常见结构：带内参比溶液电极，无内参,比溶液电极，复合电极。,带内参比溶液电极：,内参比电极一般是,Ag|AgCl,电极，内参比,溶液一般由电极种类,所决定，如氟电极，,一般用,3.0mmol/L NaF,18,无内参比溶液电极,：是一种全固,态电极，内参比电极一般使用一,根导体银丝直接与固态膜焊接，,固态压片膜的一个表面加一层银,粉，再将银丝焊接上去。,复合电极的,外参比电极,复合电极,：它与外参比电极组,合成一个测量电池，测量时免,去了常用分开的参比电极，结,构更加紧凑。,19,2,、非晶体膜传感器,膜是由一种含有离子型物质或不带电荷的,支撑体组成，这种支撑体是多孔性的膜或无孔,的膜。膜电位是由于膜相中存在着离子交换而,引起的。分为,硬质,和,流动载体,传感器。,硬质传感器的膜由具有离子交换功能的玻,璃熔融烧制而成，又称为,玻璃电极,。玻璃敏感,膜的组成一般为,Na,2,O,、,SiO,2,、,CaO,和,A1,2,O,3,等，,根据其组分和含量的不同，玻璃电极可以响应,不同的离子。,20,流动载体传感器：敏感膜是由某种有机液体,离子交换剂制成，由电活性物质（载体）、,溶剂（增塑剂）、基体（微孔支持体）组成。,l,：内充溶液,2,：,Ag,AgCl,内参比电极,3,：,液体离子交换剂,4,：,浸有液体离子交换剂的,多孔性膜,液体,离子交换剂与被测离子结合,，能在膜中迁移，,溶液中,反号离子被排斥在膜之外,，引起相界面电荷分,布不均匀，,形成界面电势差,。,21,常用流动载体传感器,传感器,Ca,2,活性物质,二（正辛基苯基）磷,酸钙,溶于苯基磷酸二辛酯,缬氨霉素,二癸基磷酸钙溶于癸,醇,四（十二烷基）硝酸,铵,邻二氮杂菲铁,(II),配合,物,三庚基十二烷基氟硼,酸铵,线性响应浓度,范围,c/(mol,?,L,1,),主要干扰离子,1,?,10,5,1,?,10,1,Zn,2,Mn,2,Cu,2,K,水硬度,Ca,2,Mg,2,NO,3,ClO,4,BF,4,1,?,10,6,1,?,10,1,Cs,NH,4,1,?,10,5,1,?,10,1,Na,K,Ba,2,Sr,Cu,2,Ni,2,Zn,2,Fe,2,5,?,10,6,1,?,10,1,NO,2,Br,I,ClO,4,1,?,10,5,1,?,10,1,OH,1,?,10,6,1,?,10,1,I,SCN,ClO,4,22,三、离子传感器的响应机理,溶液中的离子与敏感膜上,的离子之间发生交换作用,敏感膜内外,产生电位差,敏感膜内外,离子活度差,膜电位,?,M,2,.,303,RT,K,?,l,g,?,对于阳离子：,?,M,?,阳离子,nF,2,.,303,RT,K,l,g,?,对于阴离子：,?,M,?,阴离子,nF,23,四、离子选择性场效应晶体管型离子传感器,ISFET,是一种将离子选择性,敏感膜,与半导体,场,效应器件,结合起来的微电子离子选择性敏感器件，,其核心部件是场效应晶体管,(FET),溶液中敏感,离子的活度,与,电位间,存在能斯特关系，,而电位能控制场效应晶体管,漏电流,的变化，因此测定漏,电流便可知离子的活度。,24,ISFET,的主要特点：,属于固态传感器，机械性能好、耐震动、,寿命长；,构造简单，体积小，便于批量制作，成,本低，便于微型化；,适应温度范围宽；,输出阻杭低，与检测器的连接线甚至不,用屏蔽，不受外来电场干扰，测试电路简化；,可在同一硅片上集成多种传感器，对样,品中不同成分同时进行测量分析。,25,第三节,电化学气体传感器,气体传感器：能,感知,环境中,某种气体及,其浓度,的一种装置或器件，它能将气体种类,和浓度有关的信息转换成可测量的信号。,电子鼻,是一种,20,世纪,90,年代发展起来的,新颖的分析、识别和检测复杂嗅味及大多数,挥发性成份的仪器，是由一定选择性的传感,器阵列和适当的图像识别装置组成的仪器，,能够识别单一的或复合的气味；是模拟动物,嗅觉器官开发出一种高科技产品。,26,气体传感器有,电化学型,、光学型、半导,体型、热导型、表面声波型等种类。,电化学气体传感器优点：能满足一般检测,所需要的灵敏度和准确性，体积小、操作简,单、携带方便、,可用于现场监测,，价格低廉。,电化学气体传感器按照工作原理分为,电位,型气体传感器,、,电流型气体传感器,（又称控,制电位电解型气体传感器）等,。,27,一、电流型电化学气体传感器,1,、,Clark,电极（溶解氧电极）,Clark,电极是一种测定溶解在液体中的氧的,电流型电极，最早由,Clark,在,1956,年发明。,Clark,电极是一种封闭式电极，它用一疏,水,透气膜,将电解池体系与待测体系分开。待测,的氧可以通过透气膜扩散到电极内，而待测溶,液中的其他杂质不能透过，这样可以有效地防,止电极被待测溶液中某些组分污染而中毒。,28,绝缘材料,Ag/AgCl,参比电极,电解质溶液,透氧膜,双层膜,：,透气膜,（将电极、电解液与待测溶液分,开）；,液膜,（在透气膜与电极之间很薄的由电解液,形成的，约,515,?,m,）。透气膜多为聚四氟乙烯膜。,氧气进入膜后在电极表面迅速还原，外,电路检测的氧气,还原电流正比氧气的浓度,。,29,Clark,电极被广泛应用于水质处理、水文监,测、污水处理、游泳池、鱼塘和化肥、化工、,生物等领域的含氧量监测，测定水中溶解氧,以研究光合、呼吸作用等。,优点,：稳定性好，膜不易损坏、抗污染,。,缺点,：传感器的响应时间较长（气体扩散到,电极表面的速度很慢，气体在液膜中的扩散,为整个电极过程的控制步骤,），响应信号低，,温度系数大。,30,2,、,CO,气体传感器,工作原理：待测物的浓度（压力）与所产,生的电流信号成线性关系。,31,CO,传感器工作过程：,(1),被测,气体进入传感器的气室,。自由扩散或机,械泵入。气体先经过滤器：保护传感器（滤掉,被测气体中的颗粒），提高选择性（滤掉电活,性干扰物）。,(2),反应物从气室到达多孔膜，并,向电极一电解,液界面扩散,。多孔膜作用：防止传感器的漏液,现象、进一步提高选择性。,(3),电活性物质在电解液中的溶解,。物质穿过气,液界面的速度和气体在电解液中的溶解速度决,定传感器的响应灵敏度和响应时间。,32,(4),电活性物质在电极表面吸附,。,(5),扩散控制,下的,电化学反应,。,当被测气体为,CO,，对电极为空气电极时：,工作电极：,CO,H,2,O,?,CO,2,2H,2e,对电极：,1/2 O,2,2H,2e,?,H,2,O,总反应：,CO,1/2 O,2,?,CO,2,扩散控制下的电流,i,和溶液中被测物质,的浓度成正比关系：,i,nFA,c,/,?,D,t,t,?,1,/,2,1,/,2,1,/,2,A,为电极面积，,D,为氧化态物种的扩散系数，,t,为反应,时间，,n,为电极反应电子的计量系数。,33,(6),产物的脱附,。,如果产物解吸速度很慢，电,极可能会中毒。,(7),产物离开电极表面的扩散,。,(8),产物的排除,。净化传感器内部空间。如果,产物极易溶于电解液，将使传感器内部成分,改变，传感器的信号响应则改变。,CO,传感器,用酸性电解液。,影响传感器的响应特性的因数：,进样速度、,工作电极成分、电解液的类型与用量、膜的孔,积率和渗透力、工作电极的电位,等。,34,电化学,CO,气体传感器结构：电极、过滤,器、透气膜、电解液、电极引出线（管脚）、,壳体等。,CO,气体传感器与报警器配套使用，是报警,器中的核心检测元件。当一氧化碳扩散到气体,传感器时，其输出端产生电流输出，提供给报,警器中的采样电路，经报警器的中间电路转换,放大输出，以驱动不同的执行装置，完成声、,光和电等检测与报警功能。,35,3,、电流型气体传感器优缺点,优点,：检测气体种类多，测量浓度范围,宽，精度高，便于携带，可用于现场直接监,测。,不足,：电解液的蒸发或污染导致传感器,信号衰减，,使用寿命短,；催化剂长期与电解,液直接接触，使,催化活性降低,；在干燥的气,氛中，传感器中的,电解液很容易失水,而干涸，,致使传感器失效；容易,发生漏液现象,，腐蚀,电子线路；传感器的,微型化困难,。,36,二、固体电解质气体传感器,固体电解质类型：,高温陶瓷型,、快离子,导体类、高聚物。,氧化锆固体电解质氧气传感器原理：,稳定化的二氧化锆对氧离子具传导性。,稳定化的,ZrO,2,：,ZrO,2,中分别加入,10,15,（摩尔比）,CaO,和,Y,2,O,3,并使之固溶。该,物质具有大量由氧气逸出而形成的,离子性晶,格缺陷,，在,500,600,o,C,以上形成,氧离子选择,性透过,的离子导体。,37,氧化锆,氧传感器构成：,氧化锆固体电解,质为薄膜，两边,安装上多孔性铂,电极。,Pt,P,?,(O,2,),待测气体,Pt,P,?,(O,2,),基准气体,V,若两侧氧分压不同，则氧气从高压一侧透,过氧化锆薄膜向低压一侧扩散，在薄膜两侧,会产生电势差，即构成膜电势：,RT,P,(,O,2,),?,M,?,ln,4,F,P,(,O,2,),38,三、湿敏传感器,某些敏感材料能产生与,湿度,（水蒸气含量）,有关的物理效应或化学反应，将湿度的变化转,换成某个,电信号（,电阻、电容值等）。,1,、高分子电阻湿敏传感器,高分子电解质感湿材料吸收水分后引起,两电极间电阻的变化，将相对湿度的变化转,换成电阻的变化。,组成：感湿层、电极和具有一定机械强,度的绝缘基片等。,39,2,、高分子电容湿敏传感器,当环境相对湿度增大时，环境气氛中的,水分子沿着电极的毛细微孔进入感湿膜面被,吸附，使两块电极之间的介质相对介电常数,大为增加，所以电容量增大。,组成：在微晶玻璃衬底上，利用具有很,大吸湿性的绝缘材料作为电容传感器的介质，,在其两侧面镀上多孔性电极,。,优点：测全湿范围的湿度，线性好，重,复性好，滞后小，响应快，尺寸小。,40,3,、半导体陶瓷湿敏传感器,当环境湿度发生改变时，多孔感湿陶瓷,吸湿，电阻值随之变化。,组成：由多孔感湿陶瓷薄片的两面加上,两个电极，再焊出引线；外面围绕镍镉加热,丝，并由引脚引出；把它们固定在绝缘陶瓷,底座上,。,注意：为了防止电阻极化，测量时必须,是交流；在高温、高湿环境下，要定期加热,清洗，使传感器恢复性能。,41,第四节,电化学生物传感器,一、生物传感器,将生物体的成份（酶、抗原、抗体、,DNA,等）或细胞、组织固定化在载体上作为,敏感元件,的传感器称为生物传感器。,生物分子识别元件,（感受器）：具有分子,识别能力的生物活性物质（如组织、细胞、,细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸等）。,信号转换器,：电化学传感器、光学检测元,件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶,体及表面等离子共振器件等。,42,生物传感器原理,接受器,换能器,放大,信号测量,敏感元,生物催化反应专一性,?,生物传感器具有良好的选择性,43,生物传感器优点,1,、选择性好，,样品不需预处理，测定时,一般不需另加其它试剂。,2,、体积小，可实现连续在线监测。,3,、响应快、样品用量少；,且由于敏感材,料是固定化的，可以反复多次使用。,4,、,传感器连同测定仪的,成本,远,低,于大型,的分析仪器，因而便于推广普及。,44,生物传感器的应用,环境检测,生物医学,生物传感器,军事,体育运动,食品,和药物,分析,45,生物传感器分类,敏感元,按敏感材料分类,按信号转换器分类,信号转换器,可交叉,酶,抗原或抗体,微生物,细胞,组织,酶传感器,电化学传感器,电化学传感器,酶传感器,免疫传感器,微生物传感器,细胞传感器,组织传感器,电化学装置,半导体传感器,场效应管,光学传感器,光纤,测热型传感器,热敏电阻,测声型传感器,SAW,装置,46,二、电化学生物传感器原理,待测物,物理、化学变化,电,信,号,信,号,测,量,信,号,处,理,敏感物,敏,感,元,固定载体,电极,电流法,电位法,安培法,生物电极,47,生物电极的构筑,关键因素,生物分子固,定方法,吸附、包埋、交联、,化学键合,?,生物分子固,定材料,无机材料、有机材,料、复合材料,48,三、生物分子固定化,1,、生物分子固定化方法与载体选择原则,?,保持生物分子的催化,活性,和,专一性,?,生物分子与载体,结合牢固,?,固定化生物分子要有最小的,空间位阻,?,载体要有一定的,机械强度,?,载体,稳定,，不可与底物、产物反应,?,载体具有,生物相容性,49,2,、生物分子常规固定化方法,?,?,?,?,吸附法,包埋法,共价结合法,交联法,50,（,1,）吸附法,通过载体表面和生物分子表面间的,次级,键相互作用,而达到固定目的的方法。,将生物分子溶液与具有,活泼表面,的吸附,剂接触，再经洗涤除去未吸附的生物分子。,是最简单的固定化技术，在经济上也最具有,吸引力。,51,根据吸附剂的特点又分为：,物理吸附法,：,通过氢键、疏水键、电子亲和力等,物理作用力将生物分子吸附于不溶性载体。,常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、,磷酸钙胶、微空玻璃等,无机吸附剂,，,纤维素、,胶原以及火棉胶等,有机吸附剂,。,离子结合法,：,在适宜的,pH,和离子强度条件下，利用,生物分子的侧链解离基团和离子交换基间的相互,作用而达到固定化。,最常用的交换剂有,CM-,纤维素、,DEAE-,纤维素、,DEAE-,葡聚糖凝胶等。,离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。,52,影响生物分子在载体上吸附程度的因素,:,1.,pH,：影响载体和生物分子电荷,从而影响吸附。,2.,离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。,3.,生物分子浓度,：若吸附剂的量固定，随生物分子浓,度增加，吸附量也增加，直至饱和。,4.,温度,：生物蛋白往往是随温度上升而减少吸附。,5.,吸附速度,：生物蛋白在固体载体上的吸附速度要比,小分子慢得多。,6.,载体,：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。,多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面,积的大小。,53,吸附法的优缺点,吸附法的优点：,操作简单，条件温和,，可,供选择的载体类型多，吸附过程可同时达,到纯化和固化的目的，所得到的固定化生,物蛋白使用失活后可以重新活化和再生。,吸附法的缺点,：,生物分子与载体的结合力,不强,，易脱落，会导致催化活力的丧失和,沾污反应产物。所得到的传感器稳定性、,重现性差，灵敏度低,、使用寿命短。,54,（,2,）包埋法,将载体（聚合物等）与生物分子溶液混,合，借助物理作用，生物分子被包埋在载体,中以达到固定化。包埋法操作简单，由于生,物分子只被包埋，未发生化学反应，可得高,活力的固定化生物蛋白。对大多数生物分子,甚至完整的微生物细胞都适用。,55,包埋法包括凝胶包埋法和微囊化包埋法：,凝胶包埋法（胶格包埋法）：将生物分子,包埋在高聚物网格内的包埋方法。,聚丙烯酰胺,包埋法,：丙烯酰胺单体、交联剂和蛋,白混合，然后加入催化剂使之开始聚合，结果就在,生物分子周围形成交联的高聚物网络。,海藻酸钠,也可以用来作为包埋载体，它从海藻中,提取出来，可被多价离子,Ca,2+,、,Al,3+,凝胶化,。,K-,角叉莱胶,（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金,属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。,固定化的蛋白回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。,明胶、壳聚糖,等也是常用的包埋载体。,56,微囊化包埋法：将生物分子包埋于具有半透性,聚合物膜的微囊内。,它使蛋白存在于类似细胞内的,环境中，从而增加了生物分子的稳定性。,?,界面沉淀法,是一种简单的物理微囊化法，它是利用某,些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成,的皮膜将蛋白包埋。,?,界面聚合法,是用化学手段制备微囊的方法。他所得的,微囊外观好，但不稳定，有些生物分子还会因在包埋,过程中发生化学反应而失活。,?,表面活性剂乳化液膜包埋法,是在水溶液中添加表面活,性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。,57,包埋法的优缺点,包埋法的优点：,是一种反应条件温和、,很少改变生物蛋白结构但是又较牢固的固定,化方法。,包埋法的缺点：,只有小分子底物和产物,可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产,物是大分子的生物蛋白并不适合。这是由于,高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导,致固定化生物分子动力学行为改变，使活力,降低。,58,（,3,）共价结合（偶联）法,生物蛋白分子上的功能基团和固相支持,物表面上的反应基团之间形成共价键，因而,将生物分子固定在支持物上,（借助共价键将,生物蛋白的非活性侧链基团和载体的功能基,团进行偶联）。,59,共价偶联法操作原则：,（,a,）,载体,的物化性质要求载体,亲水,，并,且有一定的,机械强度,和,稳定性,，同时具备在,温和条件下与生物分子结合的,功能基团,。,（,b,）偶联反应的,反应条件,必须在,温和,pH,、,中等离子强度,和,低温,的缓冲溶液中。,（,c,）所选择的偶联反应要尽量考虑到对,蛋白的其它功能基团,副反应尽可能少,。,（,d,）要考虑到蛋白固定化后的,构型,，尽,量减少载体的,空间位阻,对蛋白活力的影响。,60,生物蛋白可提供的与载体连接的功能基团：,蛋白,N,端的氨基；,蛋白,C-,端的羧基以及,Asp,残基的,-,羧基和,Glu,残基,-,羧基；,Cys,残基的巯基；,Ser,、,Tyr,、,Thr,残基的羟基；,Phe,和,Tyr,残基的苯环；,His,残基的咪唑基；,Trp,残基的吲哚基。,在实际中偶联最普遍的基团是：,氨基、羧,基、,苯环。被偶联的基团还应是生物分子活性,的非必需基团，否则将导致生物蛋白失活。,61,共价偶联法,载体的选择的一般要求,:,一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化生,物分子活力及其稳定性上都优于疏水载体。,载体结构疏松，表面积大，有一定的机械,强度。,载体必须有在温和条件与生物蛋白共价结,合的功能基团。,载体没有或很少有非专一性吸附。,载体来源容易，能反复使用。,62,偶联反应：,?,缩合反应,：一些带羧基或氨基的载体用碳化二亚胺活,化后，与生物蛋白分子的氨基或羧基直接偶联。,?,酸酐反应,：在己二胺作用下，酸酐与生物蛋白的氨基,起偶联反应。,?,重氮反应,：将带芳香族氨基的载体，先用,NaNO,2,和稀,盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再与生物蛋白发生偶联。,?,异硫氰酸反应,：含有芳香氨基的载体，与光气反应生,成异硫氰酸，再与酶分子的氨基连接。,?,活化酯法,：含羧基的载体在二环己基碳二亚胺存在下,用,N,羟基琥珀酰亚胺活化，再连接生物蛋白。,?,酰氯化反应,：含羧基载体，用氯化亚砜处理，生成酰,氯衍生物，再与蛋白的氨基偶联。,63,共价偶联法的优缺点,共价偶联法的优点,：通过键的形成将生物,分子固定于固体表面，不易发生分子的泄漏，,并且改善了生物分子在表面的定向、均匀分布,状况。得到的固定化蛋白结合牢固、稳定性好、,利于连续使用。,共价偶联法的缺点,：,载体活化的操作复杂、,耗时，反应条件激烈；生物分子易失活，共价,结合会影响到蛋白的空间构象，对蛋白的催化,活性产生影响。,64,（,4,）交联法,利用双功能或多功能试剂在生物分子间,或生物分子与载体间，或生物分子与惰性蛋,白间进行交联反应，得到三维网状结构。,交联试剂：,戊二醛,、苯基二异硫氰等。,65,交联法种类,（,a,）,直接交联法,在生物分子溶液中加入适量多功能试剂，,使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于生物分,子与试剂的浓度、溶液,pH,和离子强度、温度,和反应时间之间的平衡。,（,b,）,载体交联法,用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰,高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联,生物蛋白。,66,（,c,）,辅助蛋白交联,当可得到的蛋白量有限，可以使用第二,个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使蛋,白共交联。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可,以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。,（,d,）,吸附交联法,先将蛋白吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球,状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再,用戊二醛等双功能试剂交联。,67,交联法的优缺点,交联法的优点,：通过化学键将生物分子固,定于固体表面，不易发生分子的泄漏。,交联法的缺点,：,反应难以控制，形成的蛋,白质层蓬松、坚固性差，所需生物样品量多。,单用交联法制备的固定化生物蛋白活力较,低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可,以达到既提高固定化蛋白的活力，又起到加固,的效果。,68,（,5,）四种固定化方法的特点小结,制法,特性,制备,结合力,酶活力,底物专一性,再生,固定化费用,物理吸附,包埋法,共价结合,法,共价交联,法,易,易,强,高,难,强,难,强,弱,高,中,中,无变化,无变化,有变化,有变化,可能,不可能,不可能,不可能,中,高,低,中,新方法：自组装法、,LB,膜法、电化学法、多方法复合等,69,3,、生物分子固定的载体材料,无机材料,成膜性,不好,聚合物材料,好,渗透性,固定量,对酶影响,结合力,好,较高,基本不影响酶结构,一般不高,一般,一般,基本不影响酶结构,一般较高,无机、聚合物复合材料可改善固定化生物分子的性能,70,4,、生物分子固定化发展方向,优越的固定材料,突破瓶颈,优异的固定方法,拓展应用,71,四、电化学酶传感器,1,、电化学酶传感器特点与分类,电化学酶传感器是由,固定化酶,与,电化学,传感器,组合而成的生物传感器。,酶具有,高效催化性,和,高度专一性,，使得,传感器具有高度的选择性。,电化学酶传感器,选择性高,、,响应快,、灵,敏度高、操作简便，能快速测定试液中某一,给定化合物的浓度，且,需样品量很少,。,72,依据酶与电极之间的电子传递机理，将,酶传感器分为三代：,根据电化学测量信号，酶传感器主要分,为,电流型,和,电位型,。,73,2,、电流型酶传感器,将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化,或还原反应产生的电流信号，在恒电位下，,所测,电流,信号与,被测物浓度,呈,线性关系,。,测定对象,葡萄糖,半乳糖,尿酸,葡萄糖氧化酶,半乳糖氧化酶,尿酸酶,酶,基本传感器,O,2,H,2,O,2,O,2,H,2,O,2,O,2,H,2,O,2,乳酸,胆固醇,L,氨基酸,乳酸氧化酶,胆固醇氧化酶,L,一氨基酸氧化酶,O,2,H,2,O,2,O,2,H,2,O,2,H,2,O,2,I,2,O,2,单胺,苯酚,乙醇,单胺氧化酶,酪氨酸酶,乙醇氧化酶,O,2,醌,O,2,，,H,2,O,2,74,（,1,）葡萄糖传感器,C,H,O,?,2,H,O,?,O,?,?,?,?,?,?,C,H,O,?,2,H,O,6,12,6,2,葡萄糖氧化酶,2,6,12,7,2,2,生物分子识别元件：,葡萄糖氧化酶膜,可测量：,O,2,的减少量，葡萄糖酸或,H,2,O,2,产生量,75,O,2,2e,-,GOD,O,2,Glucose,H,2,O,2,Electrode,E=0.6 V,Glucnolactone,Solution,Biomembrane,H,2,O,2,氧化产生的电流与葡萄糖浓度成正比。,该方法灵敏度高，其最低检出限达,10 nM,。但,工作电位较高，电活性物质（维生素,C,、尿酸,等）产生干扰。,76,（,2,）乙醇传感器,C,H,OH,?,O,?,?,?,?,?,CH,CHO,?,H,O,2,5,乙醇氧化酶,2,3,2,生物分子识别元件：,乙醇氧化酶膜,可测量：,O,2,的减少量，,H,2,O,2,产生量,C,H,OH,?,Ox,?,?,?,?,?,CH,CHO,?,Re,d,2,5,乙醇脱氢酶,3,生物分子识别元件：,乙醇脱氢酶膜,可测量：,Ox,电子传递介质（二茂铁、四硫富瓦,烯等）,77,（,3,）酚传感器,O,H,P,P,O,O,2,O,H,O,H,P,P,O,O,2,O,O,-0.2 V,OH,OH,OH,E,l,e,c,t,r,o,d,e,OH,2e,-,O,PPO,O,2,O,Biomembrane,Solution,78,3,、电位型酶传感器,将酶促反应所引起的物质量的变化转变,成电位信号输出，,电位,信号大小与,底物浓度,的对数,值呈,线性,关系。,基本传感器：,pH,电极,、,气敏电极,（,CO,2,、,NH,3,）等，直接影响酶电极性能。,例：尿素传感器,脲酶,(,NH,),CO,?,H,O,?,?,?,?,2,NH,?,CO,2,2,2,3,2,常用氨敏电极测定，用于临床全血、血清、,尿液等样品中尿素含量的测定及尿素生产线,监测分析。,79,五、,电化学,DNA,传感器,基因传感器,包括,DNA,生物传感器,和,RNA,生,物传感器两大类,根据信号转换器的不同，基因传感器可分,为电化学型、光学型和质量型等。,电化学,DNA,传感器根据工作原理的不同可,分为,电流型,、电致化学发光型及电导型等,电流型,DNA,传感器由,DNA,片断电极和电,活性指示剂构成。利用电活性分子来指示杂,交前后信号变化，选择性地识别,DNA,。,80,（,1,）电流型,DNA,传感器的基本结构及工作原理,活化,?,固定单链,DNA,?,引入电化学活性,标识物,?,杂交反应,?,电化学检测,81,（,2,）电化学活性识别物类型,?,以电化学活性的杂交指示剂作为识别物。杂,交指示剂与电极表面的,d.sDNA,形成复合物，,通过测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别,和测定,DNA,分子。,?,寡聚核苷酸上修饰电化学活性的官能团作为,识别物。,?,利用酶的化学放大功能在,DNA,分子上标记酶,作为识别物。,82,（,3,）电化学,DNA,传感器的应用,?,基因分析。,用于特定基因的检测，具有简便、,快速、成本低等优点。,?,药物分析,。利用药物与核酸之间存在可逆作,用。,?,环境污染监测中的应用,。受感染微生物的核,酸序列分析、微量污染物的监测；研究污染物,与,DNA,之间的相互作用，解释污染物毒性作,用机理。,83,第五节,超微电极,超微电极：电极的一维尺寸为微米或纳米级,一、超微电极的电化学特性,?,超微电极固有的很,小的,RC,时间常数,(,?,s),使之可以用来对快速、暂态电化学反应进,行研究，在扫描伏安测量中，,扫描速率高,达,2,?,10,4,V,?,s,1,，比常规电极快,3,个数量级。,?,超微电极上的物质,扩散极快,，可以用稳态,伏安法测定快速异相速率常数。,84,?,超微电极的,极化电流很小,（,nApA,级），,降低了体系的,IR,降，使之可以用于高电阻的,体系中，包括低支持电解质浓度甚至无支持,电解质溶液、气相体系、半固态和全固态体,系；,可采用双电极体系,（参比电极兼作辅助,电极），简化了实验方法及实验设备，提高,了测量系统的信噪比。,?,超微电极小的尺寸确保在,实验过程中不会,改变或破坏被测物体,，使得超微电极特别,适,用于生物活体检测,。,85,二、超微电极结构,制备技术：光刻、超细纤维等,制备材料：碳纤维、铂、金、铜、钨等,超微电极类型：圆盘、圆环极、圆柱、球,形、半扁球、带状、阵列型、叉指形电极,碳纤维超微电极,的结构示意图,86,三、超微电极在生物细胞体内检测中的应用,脑神经组织中多巴胺、儿茶胺的实时监测。,单细胞检测,87,四、超微修饰电极,通过在超微电极表面的分子修饰，可按意,图给电极预定功能，以便选择性地测定。,例：在超微电极上修饰,Nafion,膜，可有助于排除其他,生物物质的干扰，对神经递质多巴胺进行选择性的测,定，同时借助超微电极的特性，降低样品的检测限，,将生物物质的分析提高到细胞水平,。,例：用组合式超微修饰电极可进一步放大电信号，提,高灵敏度。,例：采用碳纳米材料可直接构筑,纳米电极,或纳米修饰,电极，可实现信号放大，用于痕量物质的测定。,88,作业：,阅读,近三年来的相关文献,，了解某一,电流型生,物传感器,：,（,1,）,测定原理,（,2,）,至少举出,5,例,：详细说明,生物电极构筑方法,（包括固定材料和固定方法）；列表说明相应的,传,感器性能,（包括灵敏度、检测限、稳定性、响应时,间等）,（,3,）该生物传感器的可能的,应用领域和前景,。,要求：,制作,PPT,，分组汇报,；,列出所阅读的参,考文献,。,89,分组及汇报主题：,第一组：学号尾数为,1,、,2,的同学，,酚,传感器,第二组：学号尾数为,3,、,4,的同学，,尿酸,传感器,第三组：学号尾数为,5,、,6,的同学，,胆碱,传感器,第四组：学号尾数为,7,、,8,的同学，,黄嘌呤,传感器,第五组：学号尾数为,9,、,0,的同学，,乳酸,传感器,每组选,一名同学汇报,，并在最后一页给出,各组员对作业的贡献。,周日前将,PPT,上传到网络平台。,90,