第四章-食品毒理学实验基础课件.ppt

第四章 食品毒理学实验基础,第一节：常见实验动物选择和处理,（一）实验动物的定义及其在科学研究中的意义1定义：实验动物（Laboratory Animal Sciences）：由人工选育，在一定条件下繁殖生产，具有明确的遗传背景和生物学特性，专门用于科学研究并符合一定标准的各种动物。实验动物种类：很多，常见包括：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗、猫、猴、小型猪、鸡（SPF鸡）、青蛙、蟾蜍、鱼类等。,实验动物的特点：具有较小的个体差异，较强敏感性，较好的重复性与较一致的反应性。一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科学界所公认。,2意义实验动物是生命科学（生物、医学、食品等）研究的重要基础和支撑条件，在科研、教学、生产、检定、安全评价和成果评定中都离不开实验动物，被称为“活的仪器”，“活试剂”。英国一位科学家曾这样比喻：“在生命科学研究中使用实验动物就象在分析化学中使用分析天平一样重要”。,实验动物在科学研究中占有重要地位。美国生命科学研究课题投资40%涉及实验动物，60%的生物学课题需要实验动物。如美国肿瘤研究中心，每年研究经费2.2亿美元，利用实验动物的课题占1.4亿美元。我国生物医学科研课题也有60上使用实验动物。,实验动物的品种品系,“种”，是生物学上的一个基本分类单位，是自然选择的产物。“品种”，则是应用动物学上的一个基本分类单位，尤其是畜牧学与实验动物科学，“品种”是人工选育的产物。,实用性 遗传的稳定性 同质性 具有一定的数量“品系”：来源于同一优良品种祖先的后裔群。,形成品种的条件,实验动物的级别分类,级别分类，一般是按实验动物的微生物背景划分的，这是实验动物质量控制的一个重要方面。国际上一般分为四级：无菌动物（germfree animal,GF）悉生动物（gnotobiotic animal,GN）无特定病原体动物（specific pathogen free animal,SPF）普通动物（conventional animal,CV）,对微生物的控制要求GF：以无菌技术获得，不带任何微生物和 寄生虫，在隔离系统饲养。GN：带有明确的微生物丛，无菌条件饲育，在隔离系统饲养。SPF：不带指定的病原微生物和寄生虫，在 屏障系统饲养。CV：微生物、寄生虫携带性情况不明，但 不能带有人畜共患和烈性传染病原体。在开放系统饲养。,我国对实验动物级别分类（1994年国家技术监督局发布的国标）一级：CV(conventional animal)二级：CL（Clean animal）三级：SPF(specific pathogen free animal)四级：GF(germfree animal),1CV,开放系统，普通饲养，大批生产，成本低，是最低级别的实验动物。CV广泛应用于教学、预试验及一些要求不严的短期试验，生物制品生产。严格意义上讲，CV不适合于科学研究。尽管如此，CV祖先来自于SPF，剖腹产后普通化，即开放饲养，CV在饲料配方，饮水，室内温、湿度、光照、噪声仍应符合国家标准。市售和来历不明的动物为“无证动物”，试验结果不予承认。,2CL：,祖先仍是SPF或GF，屏障系统饲养。质量控制要求介于CV与SPF之间。国外无此级别，国外一般均采用SPF或GF。国内由于发展水平条件所限，作为一种过渡，暂可作为标准实验动物用于一般的科学研究。,3SPF,属健康无病动物，动物质量高，适合长期慢性实验，并能取得可靠实验结果。广泛应用于药学、毒理学、肿瘤学、免疫学、传染病学、多种诊断和疫苗生产，以及生物制品鉴定中。,屏障系统：空气经过一定的过滤净化，饲养环境保持正压，进入系统的一切物品：饲料、饮水、用具等均需经严格灭菌处理。工作人员进出消毒，衣、帽、手套、口罩均需消毒。饮水除高压消毒外，还应酸化和过滤净化。,SPF饲养环境应在绝对屏障系统隔离器中,内部空气全部由送风装置供给，并经过滤除菌，内部保持正压，利用空气梯度压力来防止外界空气进入。工作人员进入需淋浴，衣、帽、手套、口罩均需消毒，各种用品消毒，方可进入。动物饲养架及饲养盒，以连续层流（空气经初、中、高三级过滤后流入架内，在架内外形成空气压力差，在饲养层等形成一个足以抵微尘进入架内的清洁区）和空气净化，以实现空气净化的双保险作用。,4.GF,GF:无菌剖腹产，在绝对隔离器中养育。（塑料薄膜无菌隔离器）应用：在实验动物领域应用；在免疫学方面应用：是研究免疫发生机理与生产高效优质疫苗的最理想动物。用于微生物学研究：研究微生态学的最理想的动物模型。肿瘤学研究：是研究致癌机理，防癌、抗癌药物筛选的理想动物。,营养学研究：是研究营养学的良好模型。GF动物不仅用来观察肠道内细菌对代谢的影响，还用于研究限制采食，对寿命，免疫力的影响，无菌动物对诸多营养机理的分析将起到更重要的作用。毒理与药理学研究：最适合于进行慢性毒性实验，适合于新药毒性及安全性评估。在微生态制剂、生物制品、抗菌素试验研究方面具有明显优势。老年医学：无菌动物是最理想的衰老模型，无菌动物寿命明显延长。其次：在放射医学、口腔医学、军事、航天、环境医学等方面都有广泛应用。,常见实验动物的选择指南,1小鼠：用途：1.1药理毒理学实验：包括药品、生物制品、食品、日用品、化妆品、化工产品、环境监测、急性、亚急性、慢性、三致试验、LD50、药物治疗试验等。1.2肿瘤研究：可人工诱发多种癌症和白血病模型，也 可用裸鼠建立各种人类移植性肿瘤模型。可用于搞癌药物筛选，癌病因、病机、免疫学等研 究。,1.3传染病学研究：多种细菌、病毒、寄生 虫病研究。1.4遗传学研究：1.5免疫学研究：1.6老年学研究：小白鼠寿命短，晚期老年病多 发，是老年学医学研究的好材料。1.7计划生育研究：1.8呼吸、消化系统疾病研究。,2大鼠用途：2.1生理学研究2.2营养学研究：大鼠对营养缺乏比较敏感，是营 养学研究的首先动物。常用于Pr、Aa、Vit、Ca、P代谢研究。2.3药理毒理学研究：适合于心血管药物筛选，6个 月以上毒理学试验，酒精中毒等。,2.4肿瘤学研究：2.5遗传学研究：2.6传染病研究2.7实验外科学研究2.8心血管疾病研究：高血脂、动脉粥样硬化、心肌梗塞、心律失常、高血压等。2.9呼吸系统疾病研究2.10其实领域研究：,3兔3.1免疫学研究：兔对免疫刺激应答反应强烈，广泛 用于制备高效价、高特异性免疫血清。3.2毒理学研究：皮肤、眼睛、致畸因子研究。3.3生殖及避孕药物研究3.4眼科学研究：兔眼睛大而圆，便于实验操作。3.5 热原研究：兔对热原反应敏感，SPF兔是制药和 药检部门检查热原质的首选动物。,3.6心血管系统疾病研究：在高血脂、动脉粥 样硬化，弥漫性血管内凝血、心肌梗塞、心律失常、高血压等疾病研究的良好模型。3.7呼吸、消化系统疾病研究3.8传染病研究3.9泌尿系统疾病研究,4豚鼠4.1变态反应研究4.2Vc作用研究：是研究Vc功能及缺乏症 的理想动物。4.3耳科研究：豚鼠的耳蜗对声音敏感。4.4细菌学研究4.5 药理学及毒理学研究4.6补体反应试验4.7耐缺氧研究,5地鼠在实验动物中，地鼠的用量和使用范围占第三位。主要是金黄地鼠，少部分为中国地鼠。5.1肿瘤学研究：对病毒诱发的肿瘤敏感，能成 功移植某些正常或肿瘤组织细胞。5.2生理学研究5.3遗传学研究：中国地鼠染色体大，数量少，易识别，是研究染色全畸变和复制机理的好 材料。,5.4传染病研究5.5生物制品生产鉴定5.6糖尿病研究：中国地鼠可自发产生糖尿 病，可用于糖尿病研究，治疗糖尿病药 物筛选。5.7营养学研究：可用于VB2、VA、VE研究,6狗：6.1实验外科学研究6.2基础医学研究6.3疾病模型：如：营养不良、高胆固醇血症、动脉 粥样硬化、糖原缺乏等研究6.4药理毒理学研究6.5肝病研究6.6其它领域：行为学、肿瘤学、烧伤等研究。,7非人灵长类7.1生理学研究7.2传染病研究7.3药理学研究7.4心血管疾病研究7.5艾滋病研究7.6其它方面,8猪8.1心血管疾病研究：是研究冠状A、脑血管 疾病和动脉粥样硬化的良好动物模型。8.2皮肤烧伤研究8.3肿瘤研究8.4其它方面：可用于小儿营养学，免疫系 统，某些遗传病及肥胖症方面研究。,9鸡主要用于高血脂症、动脉粥样硬化、性激素研究、血凝试验。鸡胚可作为病毒试验和疫苗制备的原材料。,实验动物的选择原则,1近似性原则：实验动物在结构、功能、群体分布，疾病状态等方面与人类有一定的相似性和可比性。比较医学（comparative medicine）以人类疾病预防和治疗为目的，应选择进化阶段较高的实验动物：,灵长类：猴、猩猩、狒狒、长臂猿等。大型灵长类动物，数量少，价格昂贵，不易获得，遗传和微生物控制较困难，在生物医学实验中未能普及使用。狗：血液循环、神经系统、消化过程与人相似，适于作营养学、毒理学、生理学及实验外科学研究。猪：皮肤组织结构与人相似，内分泌及代谢也相似（小型猪）。两栖类（蛙、蟾蜍）：为低等动物，与人类相差甚远，只适用于简单反射弧试验。,2差异性原则：当研究过程要求以某些差异指标或特殊条件时，选用不同种系实验动物某些特殊反应，更适合于不同研究目的和要求。弱毒疫苗的研制是利用不同种属动物的易感性差异来进行的。,3易化原则：进化程度愈高，结构功能愈复杂的动物，往往给实验控制条件或实验结果分析带来困难，这是就应从易化角度入手，选择那些既能满足实验要求，结构功能又简单，便于分析的动物。如反射弧的研究选择两栖动物，遗传学研究选择果蝇。,4相容和匹配原则：在设计实验时，所选用的动物品质要与实验设计、实验条件、实验者的技术、方法、试剂等相匹配。避免应用高精度仪器、先进技术方法、高纯试剂与低品质、非标准化实验动物相匹配，也避免用低性能测试手段，非标准化实验方法与高质量，标准化实验动物相匹配。购回SPF、GF动物如果在普通环境下进行实验，是不相匹配的。,5可获得性原则啮齿类动物具有易繁殖、多胎性、易饲养、易进行遗传和微生物控制等特点，所以应用最为广泛。6重复性和均一性原则：采用标准化实验动物：近交系、F1动物、突变系动物均具有很好的均一性和可重复性。7其它原则：根据实验目的，注意性别、年龄、体重、品系、生理状况、营养状况、饲养环境等。,实验动物的处理,1.健康检疫2.实验动物的抓取和固定方法3.性别鉴定4.实验动物的编号和标记方法5.实验动物被毛的去除方法6.实验动物的麻醉,(三)试验动物染毒方法及处置,染毒方法原则:,尽量使受试动物与人对受试物的实际接触途径相一致。食品毒理学一般选用经口途径。,经口染毒：,a.灌胃:将受试物配成一定浓度的溶液，一次导入胃内。小鼠:0.2-1.0ml/只/次;或0.1-0.5ml/10g.bw.大鼠:不超过5ml/只/次;或0.5-1.0ml/100g.bw.家兔:不超过10ml/2kg.bw./次.狗:不超过50ml/10kg.bw./次.溶液配制:等体积不等浓度:V0,Cx,Cx随D增大而增大。等浓度不等体积:C0,Vx,Vx随D增大而增大。灌胃法的优缺点:优点：剂量准确。缺点：工作量大，操作要求谨慎。,b.饲喂 将受试物拌入饲料或饮水中,让试验动物自由摄入。优点：简单易行，符合人类接触的实际情况。缺点：有异味，动物拒食，使摄入量达不到设计剂量。易挥发物，易挥发损失，摄入量就不够准确。,c.吞咽胶囊 将受试物装入胶囊内，强行放于动物舌后咽 部，迫使其咽下。优点：剂量准确，尤其是适用于易挥发、易水解及有异味的受试物。缺点：动物有咬伤人的危险。,经呼吸道染毒,a 静式吸入染毒 将一定数量的啮齿类动物放在密闭的染毒柜中，加入易挥发的也太受试物或气态受试物使成一定浓度。优点：染毒简易 缺点：随试验进行氧分压降低，柜内受试物浓度也逐渐降低，且有经皮吸收的可能,b 动式吸入染毒 动式吸入染毒又可分为整体接触和口鼻接 触，其设备主要由染毒柜、机械通风系统、配气系统三个部分构成。优点：氧分压及受试物浓度较稳定 缺点：消耗受试物的量大，并易于污染环境 c 气管内注入,经皮染毒,将受试动物皮肤表面涂抹一定量的受试物，再用纱布及塑料薄膜盖上，用脚步固定。,注射染毒,皮内注射皮下注射腹腔注射肌内注射静脉注射,实验动物处置,在实验动物功能评价中，需要采集的生物样品主要是血液、尿液、胆汁等，它是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最为重要的途径。,常用采血部位及方法,1.割尾采血法常用于大小鼠，小量采血。可以多次采血。0.1ml/次。方法：老鼠尾巴用温水（50）浸泡几分钟或放恒温箱几分钟，使其尾巴血管充 盈，剪去尾巴1-2mm.,2.刺尾采血法 常用于大鼠，取血量很少。方法：鼠尾用温水擦拭，乙醇消毒，用7号或8号枕头，刺入鼠尾静脉，拔出枕头即有血滴出，,3.眼眶后静脉丛取血 常用于大小鼠、沙鼠的常规血液检查。微量采血。0.2-0.3ml/次。方法：左手抓鼠，固定头部并压迫颈部两侧，是眼球突出，框后静脉丛充血，取内径为1.0-1.5mm的玻璃毛细管，刺入眼睑与眼球之间，旋转采血管，然后取出血液。,4.腹腔静动脉采血 常用于大小鼠、沙鼠。0.1-0.6ml/次 方法：动物要麻醉后进行，用针管在腹主动脉分叉处，与血管平行刺入，此法采血量大。,5.心脏采血常用于大鼠，家兔，和豚鼠。取血0.5-0.6ml/次。方法将动物固定好，剪去心前区毛，消毒，取4-5号注射器，选择心博最强出穿刺，然后迅速取出血液。,6.摘眼球采血 常用于大小鼠 方法 将动物固定，压迫颈部，使眼球突出及充血，然后用止血钳迅速摘除眼球，捅破眼球后胞膜，即可用小试管取血。,尿液的采集,代谢笼法:此法较常用于大、小鼠，成熟小鼠尿量1-3ml/24h，大鼠为55-75ml/24h导尿法：常用于雄兔、犬等动物，要轻度麻醉，可以采到无污染的尿液。压迫膀胱法：此法适用于兔、猫、犬等大动物。输尿管插管法,膀胱插管法膀胱穿刺法剖腹采尿法反射排尿法：适用于小鼠。,采粪,大、小鼠：采用代谢笼兔：大量，采用代谢笼犬、猴、猪:采集自然排出的粪便。,实验动物的安死术,实验动物的处死必须遵循实验动物的伦理要求和动物福利法按照人道主义原则处死实验动物。“安死术”的概念：即安乐死术，是指以人道的方法处死动物过程。在处死动物的过程中尽量减少动物的惊慌、焦虑，使其安静地、无痛苦地死亡。采用安死术必须符合的标准。,采用安死术必须符合的标准,1.死时无惊恐、疼痛表现。2.使其在最短时间内失去意识迅速死亡。3.方法可靠且可重复。4.对操作人员安全。5.采用的方法要与研究要求和目的一致。6.对观察者和操作者的情绪影响最小。7.对环境的影响最小。8.需要的机械设备简单、价廉、易操作。9.处死动物地点应远离并与动物房隔开。,安死术的常用方法,颈椎脱位法 是将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。空气栓塞法 处死兔、猫、犬常用此法，兔、猫为20-40ml,犬为80-150ml.过量麻醉处死 此法多用于处死大鼠、豚鼠和家兔,吸入乙醚或腹腔注射巴比妥钠。二氧化碳吸入法 让实验动物吸入大量C02等气体而中毒死亡。断头处死法、击打头盖骨处死法,第二节 食品毒理学试验的设计原则,毒理学实验通常是毒性评价或安全性评价试验，通常由权威机构规定评价程序。,在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则:1.外来化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人,基本假设为：人是最敏感的动物物种；人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重（或体表面积）相关。,2.实验动物必须暴露于高剂量 是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。,一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应（效应）关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数。,(1)毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了表征化学品可能产生的毒作用。(2)毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以被检测。,3.成年的健康实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择,(1)成年的健康（雄性和雌性未孕）实验动物作为一般人群的代表性实验模型。幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。,(2)毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。,1.对照原则,在动物实验中，要求相比较的各组间动物的种类、性别、年龄、体重等尽可能地一致。对照组与实验组同等重要，两组的动物数应相等。,(1)空白对照：又称正常对照(2)标准对照：又称有效对照或阳性对照(3)组间对照：(4)自身对照：,科研设计遵循的三原则,2.重复原则,(1)足够的实验样本数：,(2)实验结果的可重复性：,3.随机原则,为了减少个体差异这种非处理因素的干拢，应于实验前将实验动物依统计学原则进行随机分组，以此达到尽可能降低非处理因素的混杂效应，从而提高每组动物间均衡性的目的。,（1）随机分组方法：随机数字表法；计算机软件（如SPSS、SAS、Excel等）方法。,（2）例子：将32只动物按体重每4只组成一个区组，随机分配到4种处理中，共组成8个区组。,一、体外试验设计,溶剂/赋形剂受试物受试对象剂量设置代谢活化对照重复,二、体内毒理学试验设计,对照条件对照类型剂量分组,动物选择动物数量,实验动物,受试物,资料处置给予方式,对照,观察指标,指标的有效性指标的客观性指标的准确度和精密度指标的灵敏性指标的特异性选择指标的数目指标的标准化,试验期限,试验设计常用方法,完全随机设计配对设计随机去租设计析因设计拉丁方设计,第三节 毒理学试验结果处理和分析,在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。统计检验的假设是关于总体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是绝对的肯定或否定，不等同于有或无生物学意义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该根据统计学分析的结果、生物学知识和经验,一、毒理学研究的数据类型,计量资料分类资料等级资料数据类型转换数据转换,二、假设检验的一般考虑,实验和观察的单位处理组建进行比较的形式建设检验和概率值,三、数据处理和统计方法,毒理学试验的数据通常是由剂量水平和相应观察值组成的二维关系型数据。毒理学试验处理组与阴性对照组观察值均数的比较，如果资料可拟合某种分布，则适用于参数检验，其敏感度和效率高于非参数检验；如资料不能拟合某些已知的分布，则应进行数据转换，以满足正态性和方差齐性。如果任何变换都不能改善数据的分布，可能存在个别可疑值，应予以识别和剔除。另一方面，可使用不依赖总体分布模型的非参数统计分析。,表 1 各处理组与阴性对照组两两比较和多个比较的统计学方法,（一）处理组与阴性对照组比较,（二）剂量-效应关系和剂量-反应关系,剂量-效应关系和剂量-反应关系是毒理学研究的重要内容。在急性毒性(LD50)研究中，就是典型的剂量-反应关系研究，LD50是统计学的点值估计和区间估计。剂量-效应关系和剂量-反应的判定可以分为定性和定量统计学两大类。趋势检验：剂量-效应关系和剂量-反应关系的统计学分析即为趋势检验,常用统计学数据处理软件,SPSSSASGenstat,表2 IPCS专家组推荐的统计学分析方法,（三）常规毒理学实验资料推荐的统计学方法,体重和器官重：体重常是毒性效应最敏感的指标之一。如果每组样品量足够大(10或10个以上)，可用下述方法：器官重量计算为体重的百分比。按体重或体重改变分析。对各组资料利用Bartlett方差齐性试验，检测方差齐性。临床化学：临床化学资料适用的统计学方法：ANOVA，Bartlett检验和或F检验，t-检验，适用于：钙、葡萄糖、BUN、肌苷、胆碱脂酶、总蛋白、白蛋白、HBDH、ALP、CPK、LDH、ALT、AST及血红蛋白。Kruskal-Wallis非参数ANOVA适用于：总胆红素、GGT。,血液学：适用的统计学方法：wilcoxon检验或多重秩和检验 适合于不是典型的正态分布，而呈多模型分布 组织病理学损害发生率：适用的统计学方法：卡方检验或Fisher精确检验适合于处理组和对照组动物病理损害发生率 Bonferroni法 多重比较,生殖毒性：生殖毒性试验一般可得4个变量：生育力指数(FI)、受孕指数(GI)、存活力指数(VI)和哺育指数(LI)。适合的统计学方法：Wilcoxon-Mann-whitney U检验或KrusKa1-Wallis非参数ANOVA样本数为10或10以上 Wilcoxon秩和检验用于样本数为10或10以下，2组比较Aruskal-wallis非参数ANOVA用于样本数为10或10以下，3组或3组以上的比较,致畸试验：适合的统计学方法：卡方检验、t-检验或ANOVA 适用于样本数为10或10以上，可近似为正态，Wilcoxon秩和检验或Kruskal-wallis非参数ANOVA 适用于样本数小于10,致突变性试验：从理论上来说，突变是罕见事件，服从泊松分布，但实际上，遗传毒理学短期试验（STT）数据分布模型很复杂，也可服从二项分布、负二项分布等。样本分布的研究可用拟合优度卡方检验、似然比检验、精确检验、Kolmogorov-Smimov检验及Fisher推荐的离差检验。Ames试验的统计学评价：遗传毒理学体内试验：行为毒理学：,图1 遗传毒理学体内试验统计学评价的程序,表2 行为毒理学的统计学方法(Gad等，1994),第三节 统计学意义和生物学意义,在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义。一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。,一、处理相关反应的确定,剂量相关趋势反应重现性相关发现组检查仪的大小和类型性别差异差异出现的时间性,二、参考范围,识别异常的阴性对照值可以更好的理解低发生率的发现可更好的理解高发生率的发现,三、生物学意义的判断,在判断生物学意义(即生物学重要性)时，可考虑以下步骤。(1)纵向比较：(2)横向比较：(3)与历史性对照比较：,分析和综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义，可能遇到四种情况，见表3。在此表中，第和第种情况最为常见，第种情况是无统计学意义也无生物学意义，第种情况是有统计学意义也有生物学意义。但是有时在实验结果中会出现第和第种情况。,表3 毒理学试验结果的统计学意义和生物学意义,谢谢！,