第十章气相色谱法课件.ppt
第三章 高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography,分析化学（仪器分析部分）,3-1 高效液相色谱特点与仪器3-2 基本原理与主要分离类型3-3 固定相与流动相3-4 影响分离的因素3-5 离子色谱法,目 录,3-1-1 高效液相色谱仪3-1-2 高效液相色谱法的特点3-1-3 流程及主要部件,3-1 高效液相色谱特点与仪器,3-1-1 高效液相色谱仪,3-1-2 高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,3-1-3 流程及主要部件,1.流程,2.主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5)液相色谱检测器,a.紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8uL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,c.示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,d.荧光检测器,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；激光诱导荧光(LIF)Laser Induced Fluorescence体积小，适合毛细管柱,3-2-1 液-固吸附色谱3-2-2 液-液分配色谱,3-2 基本原理与主要分离类型,3-2-1 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,3-2-2 液-液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,3-3-1 液相色谱固定相3-3-2 液相色谱流动相,3-3 固定相与流动相,3-3-1 液相色谱固定相,1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,（3）化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510 m；,3-3-2 液相色谱流动相,1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,3-4-1 影响分离的因素3-4-2 分离类型的选择3-4-3 液相色谱的应用3-4-4 液相制备色谱,3-4 影响分离的因素,3-4-1 影响分离的因素,1.影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2.流速,流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,3-4-2 分离类型选择,3-4-3 HPLC的应用,1.环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,
