第二章-培养基及其配制学时课件.ppt

第二章 培养基及其配制,讲授：张丽琼,培养基及其作用：是向植物细胞提供营养的场所。其作用是向植物细胞提供所需的各种营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分。固体培养基还起着支撑作用。,培养基的种类培养基的成分及作用常用培养基的配方及其特点培养基的选择培养基的配制,本章主要内容,培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 营养水平不同：基本培养基、完全培养基,一、培养基的种类,二、培养基的成分及作用,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。,无机营养成分+有机营养成分=基本培养基,Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准,A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复。C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl 7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素,1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。P是是生物膜、核苷酸（如ATP）、核酸的重要组成部分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供。,Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H2O提供。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。常以CaCl22H2O提供。,2、微量元素 在微量元素中，铁的作用最大：一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。叶绿素形成的必要条件 在制做培养基时常用FeSO47H2O和a2-EDTA结合成螯合物使用。乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物可防止铁的沉淀。,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,这些整株植物生长所必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。如缺氮，会表现出一种花色素苷的颜色，不能形成导管；缺铁，细胞停止分裂；缺硫，表现出非常明显的褪绿；缺锰或钼，则影响细胞的伸长。,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,缺锰典型症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,缺钼典型症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,缺硼典型症状：受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。,马铃薯,3、有机化合物：培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：(1)碳水化合物：碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。糖类物质特点：具有热易变的性质 利于吸收和利用 使用浓度一般在2%5%提供能源和调节渗透压,（2）维生素类 以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6 VB1(盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长。VPP(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC(抗坏血酸)：有防止组织变褐的作用。,（3）肌醇又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。用于构建细胞壁。参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动。促进活性物质发挥作用。使用肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。,（4）氨基酸 蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培养基中常用的是甘氨酸。有时用水解乳蛋白或水解酪蛋白，由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,（5）天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长 成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。天然营养混合物，对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物椰乳：它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用香蕉：主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。马铃薯：添加后可得到健壮的植株。水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸。其它：酵母提取液、麦芽提取液等。,4、培养材料的支持物（1）琼脂 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。固体培养基利于组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。是使用最普遍的凝固剂用量一般在610g/L之间颜色以浅、透明度高好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。,（2）其它：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。,5、活性炭活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛。吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根缺点：没有选择性,活性炭,茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸。在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长。活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关。,在使用活性炭时，要注意其吸附有害物质和吸附生长调节物的二重性，尤其是当较高的活性炭足以能抵消生长调节物的作用时，应注意调整好活性炭与生长调节物等培养基成分的用量，使其皆能发挥作用。在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,6、抗生素 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/l之间。添加抗生物质可防止外植体内生菌造成的污染。,7、植物激素：在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,（1）生长素类：促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素：IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸),IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低,是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2,4-D（2,4二氯苯氧乙酸）起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。,生长素作用强弱顺序：,2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根,生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2,4-D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。,（2）细胞分裂素类 这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(激动素)、ZT(玉米素)等。其中ZT活性最强，但非常昂贵。常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有以下作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。诱导胚状体和不定芽的形成促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。用于离体成花的调控。延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。溶于0.51.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中。,（3）赤霉素类和脱落酸 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力,赤霉素(GA)：培养基中添加的是GA3，主要用于刺激在培养中形成的不定胚发育成小植株，促进幼苗茎的伸长生长。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时少量可用95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70100失效，应当采用过滤灭菌法加入。,8、抗氧化物：植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。,抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50200mg/l的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其它抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、抗坏血酸及二乙基二硫氨基甲酸酯等。,9、水作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：用蒸馏水，最好是双蒸水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。,三、常用培养基的配方及其特点,（一）几种常用培养基的配方 组织培养常用的基本培养基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。,1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物,（二）、几种常见培养基的特点,2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果,3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他禾谷类植物的花粉和花药培养。,AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现浓度：1-10mg/L抗生素：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。作用：可防止外植体内生菌污染。浓度：520mg/L。,培养基基本培养基 植物激素 培养基的选择在实质上讲就是设计营养物质与激素（种类、用量）的最佳组合。,四、培养基的选择,筛选培养基常用的试验方法：单因子试验 多因子试验 逐步添加和逐步排除试验,1、单因子试验只变动一个因子，通过试验找出该因子的影响及影响程度。如：MS+BA2+NAA（0.1、0.5、1.0mg/L）MS+BA+NAA0.1（1.0、2.0、3.0 mg/L）不能反映各种单因子成分之间的组合效果与相互影响,2、多因子试验对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验。,2种激素5种浓度的实验组合（单位：mg/L）,例如研究NAA和BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的完全试验。,3、逐步添加和逐步排除的试验方法：成功前-逐步添加（各种营养成分）实验成功成功后-逐步排除（减少各种成分）缩小范围在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,科学安排研究顺序,.定基本培养基，激动素.改良基本培养基.调整蔗糖、琼脂用量.改变pH值.探讨培养的环境条件,1、母液(stock solution)的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义:保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。,五、培养基的配制,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等，一般配成比所需浓度高10100倍的母液。,母液的配制方法：,配制培养基时，为便于保存，提高效率，通常先配制母液。即配成：大量元素10倍液，定容至1000ml；微量元素100倍液，定容至1000ml；铁盐100倍液，定容至1000ml；维生素1mg/l，定容至100ml；激素1mg/l，定容至50100ml。,配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如a 2和SO4 2，a 2、g 2和PO4 3一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。,一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,培养基母液的配制,MS母液配制：MSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII铁 盐 200X MSIV有机 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml,将1、2、4、5称好放入烧杯分别溶解混合，将3最后混合，再定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS I X20 2013.9.26 HXH,注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。,将17称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS II X200 2013.9.26 HXH,MS(铁盐),配方用量mg/L,200X（mg）,称量(g),1.FeSO47H2O,27.8,5560,5.56,2.Na2EDTA2H2O,37.3,7460,7.46,将1称好放入烧杯甲溶解，将2放入烧杯乙溶解，再混合定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,1L,MS I X200 2013.9.26 HXH,将1、2、3、4称好放入烧杯分别溶解混合，定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS IV X200 2013.9.26 HXH,将肌醇称好放入烧杯溶解定容到1L，放入试剂瓶贴标签，备用,MS V X200 2013.9.26 HXH,母液配制时应注意事项：母液配好后放人冰箱内低温保存（4），用时再按比例稀释。其中III、IV、以及激素类物质应以棕色瓶盛装。母液使用前摇动瓶子，如有沉淀、絮状物、微生物污染应停止使用取样时移液管要对应取样，防止交叉污染,2、培养基的配制：MSBA2NAA0.2糖3.0琼脂0.7 pH=5.8 MS：MS I 50 mlMS II 5 mlMS III 5 mlMS IV 5 mlMS V 5 ml BA：20ml;NAA：2ml 糖：30g;琼脂：7g,V贮备液用量V配制/浓缩倍数V激素贮备液 C激素*V配制/0.1mg/ml,