第三篇第一章柠檬酸课件.ppt

1,第三篇,有机酸发酵工艺学,2,第一章 柠檬酸第一节 柠檬酸发展简史,柠檬酸是生物主要代谢产物之一。柠檬酸主要存在于1、果实2、植物叶子3、动物,3,柠檬酸1784年由Scheels氏发现1893年前，主要用柑橘、菠萝、柠檬等果实提取柠檬酸1893年德国微生物学家Wehmer发现二种青霉菌可以生成柠檬酸1917年Currie使用黑曲霉浅盘发酵生产柠檬酸1923年美国科学家研究成功了以废糖蜜为原料的浅盘法柠檬酸发酵，并在比利时设厂生产。1938年Perquin和1942年Karrow进行了柠檬酸的深层发酵研究 1951年美国Miles公司首先以淀粉质为原料，经水解后深层发酵大规模生产柠檬酸。,柠檬酸,4,柠檬酸,我国1953年刚开始也是采用浅盘法发酵生产柠檬酸，1968年用薯干为原料采用深层发酵法生产柠檬酸成功，由于工艺简单、原料丰富、发酵水平高，各地陆续办厂投产，至20世纪70年代中期，柠檬酸工业已初步形成了生产体系。,5,柠檬酸的消费领域：饮料行业占4045 食品添加剂等占1520 洗涤剂占2030 医药占5 其它占10,2004年全球柠檬酸产量约120万吨，欧盟和美国为最大消费市场。,6,欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约30万吨 美国柠檬酸年产量约25万吨 我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约50万吨 但在1970年时，我国的柠檬酸年产仅有130吨,7,柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸。我国是一个柠檬酸的生产大国，1995年的产量为16万吨，1999年底达到20万吨，其中80以上都出口国外，在国际市场上占有重要地位。,8,2000年的产量达到36.9万吨，柠檬酸及柠檬酸盐出口量为25.8万吨，分别比1999年增长了36.4%和23.3%，为历史最高水平。2001年世界柠檬酸消费量(不含中国)已经升至近200万吨，年递增率约5%，我国柠檬酸产量约为35万吨，柠檬酸及柠檬酸盐出口量为27.8万吨。2002年我国柠檬酸产量突破了40万吨，达到了40.2万吨，而柠檬酸及柠檬酸盐出口基本与2001年持平，为28.3万吨。,9,我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望,我国于五十年代初期开始柠檬酸浅盘发酵研究，1968年轻工业部发酵研究所与黑龙江和平糖厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。1965年，上海市工业微生物研究所筛选出N558菌种，并与天津工业微生物研究所，南通发酵厂等合作，使之用于工业化生产，并在全国推广，形成我国独特的薯干直接深层发酵法生产柠檬酸。,10,我国柠檬酸发酵生产的回顾和展望,从七十年代到九十年代，我国一直致力于柠檬酸生产菌种的改进，1990年，上海市工业微生物研究所完成国家七五攻关项目筛选出860菌种，发酵产酸达20，上海市工业微生物研究所开始以薯渣为主原料，以黑曲霉为菌种，固体发酵法生产柠檬酸钙的研究。并于1977年中试成功并投入生产，现在全国已有四十余个工厂，采用固体发酵法由薯渣生产柠檬酸及柠檬酸钙产品。,11,我国以石油原料发酵柠檬酸开始于1970年，先后在天津、上海、沈阳等地进行研究，并一度投入小规模试验生产，是用正烷烃为原料，以解脂假丝酵母为菌种，发酵产酸达13以上，转化率140以上，但因柠檬酸只占总酸的50%（另一半为异柠檬酸）而且由于成本较高及石油原料紧缺和食用安全性等原因，未能坚持研究和生产。,12,我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势在于：1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外要短。3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。平均产酸速率是国外的2倍。,13,总结我国的发酵技木及生产水平，特别是菌种及发酵工艺均为世界领先水平。薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深层发酵技术为我国所独有。国外发酵罐容积通常在200m3,并较早实现自动控制；我国的最大柠檬酸发酵罐为150m3,14,劣势,提取工艺和设备水平落后产品质量不高，规模效益差深层产品开发少，供大于求。,15,第二节 柠檬酸的命名及理化性质,一、柠檬酸的命名二、柠檬酸的物理性质三、柠檬酸的化学性质,16,一、柠檬酸的命名,柠檬酸是一种三元羧酸，又称枸橼酸。结构式：CH2-COOH HO-CH-COOH HO-C-COOH CH-COOH CH2-COOH CH2-COOH 柠檬酸 异柠檬酸2-羟基丙烷三羧酸（3-羟基-3-羧基戊二酸）,17,柠檬酸,分子式 C6H8O7相对分子质量 192.13商品柠檬酸：1H20物和无H2O物异柠檬酸是柠檬酸的同分异构体。发酵法(曲霉、青霉、酵母)柠檬酸生产方法 化学合成法,生产菌,18,化学合成法,以丙酮、乙烯酮或二氯丙酮为原料,Cl-CH2Cl-CH2,C=O,+HCN,Cl-CH2Cl-CH2,C,OH,CN,+2H2O,Cl-CH2Cl-CH2,C,OH,COOH,+2HCN,-2HCl,NC-CH2NC-CH2,C,OH,COOH,HOOC-CH2HOOC-CH2,C,OH,COOH,柠檬酸,+4H2O,-2NH3,二氯丙酮,19,二、柠檬酸的物理性质,柠檬酸是动物体内的一种天然成分和生理代谢的中间产物，广泛应用于食品、医药、化工等。无色透明或半透明晶体，颗粒状或粉末，无臭。有强烈酸味，稍有涩味。有风化和潮解性。物理性质,20,柠檬酸物理性质,（一）晶体形态与性质（二）柠檬酸在水中的溶解度（三）柠檬酸水溶液的性质,21,（一）晶体形态与性质,1H2O柠檬酸是低温水溶液中结晶析出，经分离干燥后的产品，含结晶水为8.58%，斜方棱晶，晶体较大。无水柠檬酸是由较高温度（36.6）水溶液中结晶析出。1H2O柠檬酸转变为无水柠檬酸的临界温度为36.6柠檬酸无旋光，也无电压效应。,22,（二）柠檬酸在水中的溶解度,柠檬酸在36.6转折点以下，溶解度曲线可以用下式表示：W1=49.9300+0.5303 t柠檬酸在36.6转折点以上，溶解度曲线可以用下式表示：W2=59.8730+2.2117（t/10）+0.03079（t/10）,23,（三）柠檬酸水溶液的性质,1、浓度升高，凝固点下降和沸点升高1532、密度 P=（1.01+0.47W）103-0.51t或查表 式中 P-密度，kg/m3 W-柠檬酸重量百分浓度，60%-1.2738 t-温度3、黏度和表面张力4、比热容5、真空下的沸点 因其沸点153，浓缩时，需要减压蒸馏。,24,三、柠檬酸的化学性质,（一）酸性与电离（二）加热分解作用（三）与碱反应（四）与酸反应（五）与甘油反应（六）氧化反应,25,（一）酸性与电离,柠檬酸是较强的有机酸，有3个H+能电离。K1 H3Ci+H2O H2Ci-+H3O+K2 H2Ci-+H2O HCi2-+H3O+K3 HCi2-+H2O Ci3-+H3O+Ci柠檬酸根,26,（二）加热分解作用,柠檬酸加热能分解成多种产物，各种产物之间的关系及转化过程，如图1-3。CH2-COOH-CO2 CH2-COOH-CO2 1 CH3 HO-C-COOH C=O 1 C=O CH2-COOH-2H CH2COOH CH3-H2O-H2O 3-酮戊二酸 丙酮 175-CO2 CH-COOH CH2 C-COOH C-COOH CH2-COOH CH2-COOH 乌头酸 衣康酸,27,（三）与碱反应,柠檬酸与K2CO3（KOH或HNO3）共熔得到草酸、HAc或其它盐类。K2CO3 H3Ci COOH+HAc 4 COOH 柠檬酸 草酸,28,（四）与酸反应,柠檬酸与发烟硫酸混合，于常温下生成戊头酸，稍加热能生成3-酮戊二酸。CH2-COOH CH-COOH CH2-COOH HO-C-COOH-CO2 C-COOH C=O CH2-COOH 60%H2SO4 CH2COOH 94%H2SO4 CH2-COOH 乌头酸 3-酮戊二酸 40 浓H2SO4 150 O CH3 C CH3+CO2+CO CH-COOH C-CO O CH2CO 乌头酸酐4,丙酮,29,（五）与甘油反应,柠檬酸与甘油混合干馏，得到柠檬酸 甘油脂。CH2-COOH CH2-OH 100 CH2-COOCH2 HO-C-COOH+C-OH OH-C COOCH CH2-COOH CH2OH CH2-COOCH2 柠檬酸 甘油 柠檬酸甘油脂,30,（六）氧化反应（1）,柠檬酸溶于NaCl与Cl2作用生成六氯丙酮，在光照下能分解成丙酮等。CH2-COOH Fe3+CH3 HO-C-COOH C=O+H2O+CO2 CH2-COOH 光 CH3 柠檬酸 丙酮,31,（六）氧化反应（2）,柠檬酸氧化生成的3-酮戊二酸与溴作用能生成戊溴丙酮沉淀，这是定性、定量柠檬酸的一种基本方法。CH2-COOH KMnO4 CH2 COOH HO-C-COOH C=O+CO2 CH2-COOH 100 CH2 COOH 柠檬酸 3-酮戊二酸,32,第三节 柠檬酸盐类的性质,一、柠檬酸三钠二、柠檬酸一钠三、柠檬酸钾盐四、柠檬酸钙盐,33,一、柠檬酸三钠,分子式C6H5Na3O72H2O，相对分子量294.10无色晶体或白色结晶性粉末无臭，有清凉咸味在常温空气中稳定，加热150失去结晶水易溶解于水。,34,二、柠檬酸一钠,分子式C6H7NaO7，相对分子量214.11白色颗粒状晶体或结晶性粉末味咸、微酸、无臭在潮湿空气中轻微潮解易溶解于水，几乎不溶解于乙醇。,35,柠檬酸钠的作用,在食品、饮料工业中用作风味剂、稳定剂；在洗涤剂工业中，可替代三聚磷酸钠作为无毒洗涤剂的助剂；还用于酿造、注射液、摄影药品和电镀等。柠檬汁中含有大量柠檬酸，柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。在临床上采取新鲜血液时,需要加入一些消毒过的柠檬酸钠或草酸钠,就能起到防止血液凝固的作用,所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗凝血剂。,36,三、柠檬酸钾盐,分子式C6H5K3O7H20，相对分子量324.41无色针状结晶味咸、无臭易潮解易溶解于水，几乎不溶解于乙醇。主要用作分析试剂，食品添加剂，在制药工业上用碱性钾盐，用作低钾血症及碱化尿液，也可制成高效复合肥料。可用于造纸、镀金等行业。,37,四、柠檬酸钙盐,分子式CaH4（C6H7O7）2 柠檬酸一钙 CaH（C6H7O7）H2O 柠檬酸氢钙 Ca3（C6H7O7）24H2O 柠檬酸三钙细小的白色棒状晶体或结晶性粉末一般有 4 个结晶水分子量 571.31,38,钙盐在水中的溶解度较小；并且随温度升高进一步降低。3种不同的钙盐在水中的溶解度见表。如果温度升高至95100，Ca3(C6H5O7)24H2O的溶解度可进一步降低为0.578g/1水。用钙盐法提纯柠檬酸时，即利用它的这种性质，将溶液加热至沸，使钙盐比较完全地析出，而其他有机钙（如葡糖酸钙）等物质溶解。若溶液呈微碱性，并且含有PO34-和过量Ca2+时，柠檬酸钙在低温时也可完全沉淀。Ca3(C6H5O7)24H2O能溶于过量的柠檬酸及氯化铵溶液中，煮沸时仍可析出。柠檬酸钙的溶解度也与酸度有关，PH值降低时溶解度增大见表，并且在酸化时可以游离出柠檬酸,39,第四节 柠檬酸的用途,一、柠檬酸在食品工业上的应用二、柠檬酸在药物、美容、化装品上应用三、柠檬酸在工业上应用,40,1、饮料,饮料工业 消耗柠檬酸占总柠檬酸生产总量 75-80%柠檬酸特性水果风味抗氧化作用增溶缓冲,水果型汽水 一般加酸量约 0.1-0.25%,果肉型固体饮料粉，柠檬酸添加量可增至 1.5-5.0%,柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料柠檬酸本身是果汁的天然成分之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；,一、柠檬酸在食品工业上的应用,41,2、果酱与果冻,柠檬酸 在果酱与果冻中的作用与在饮料中相似，主要作用 调节产品 pH 在3.0-3.4之间 赋予产品酸味,柠檬酸在果酱与果冻中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的pH值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。,42,3、糖果,柠檬酸 加到糖果中能 增加酸味 防止各种成分氧化 防止蔗糖结晶析出,43,4、冷冻食品,螯合作用调节 pH加强抗氧化剂作用使能引起鱼类腐败和贝类变质的酶失活,44,5、酿造酒,当葡萄或其他水果成熟过度而酸味不足时，可以用柠檬酸调节，能防止所酿造出的酒味淡薄。,当葡萄或其它酿酒原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。,45,6、冰淇淋、酸奶,柠檬酸 能改善口味，柠檬酸与柠檬酸钠并用还能 增加乳化稳定性，防止氧化作用，提高其稳定性。,添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。,46,7、脂肪、油,柠檬酸作为抗氧剂，并能螯合微量元素使脂肪、油和含脂肪食品不容易变质。,47,8、腌制品,各类肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸 可以 改善风味，除腥气、脱臭、抗氧化。,48,9、罐头食品、水果加工,柠檬酸用于蔬菜水果罐头，降低pH，以降低热处理温度而保持原味，柠檬酸具有调节作用螯合金属离子保护水果所含的维生素C，使其不容易被金属离子破坏防止酶氧化酚类为醌而产生褐变。,49,10、豆制品、调味品,采用柠檬酸水溶液浸泡大豆可使大豆脱腥。,50,1、药物,泡腾是大众化药物口服配料释放体系，柠檬酸与柠檬酸钠或碳酸氢钠水溶液共同反应产生大量CO2和柠檬酸钠，可使药物中的活性配料迅速溶解并增强味觉能力缓冲液 pH 3.5-4.5 能维持配料的稳定性。,二、药物、美容、化装品上应用,51,2、发蜡与化妆品,在配制发蜡过程中用柠檬酸调节pH，在抗氧化剂体系中，作为金属离子螯合剂，均需要柠檬酸作为标准配料缓冲液 pH 4.5-5.0 能增加发蜡的防腐剂作用。,52,1、金属净化,以柠檬酸为基础的金属净化配方，能有效地去除黑色金属和有色金属的表面形成的氧化物作为一种弱有机酸，它可引起金属表面层的轻微的损害加速金属氧化物的迁移。,三、柠檬酸在工业上应用,53,2、去垢剂,柠檬酸钠 能增强去污能力作为污剂产品中可加快生物降解可作为磷酸盐的代用品，大量应用于洗衣粉、去污剂中。,54,3、无土栽培技术,除去土壤中某些过量元素，如Cu、Zn、Mn、Cr等过量元素，一般采用柠檬酸 螯合此类元素,55,4、矿物和颜料方面应用,柠檬酸有分散效能，它可减少某些重要的淤浆生料的粘滞性。,56,5、环保,6、纺织品7、混凝土、灰泥、熟石膏处理8、电镀9、胶粘剂、橡胶的螯合剂。,57,第五节 柠檬酸发酵机理,一、柠檬酸发酵微生物二、柠檬酸发酵机理三、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制,58,大部分黑曲霉都能产生柠檬酸。此外，泡盛曲霉、温特曲霉、字佐美曲霉、海枣曲霉、炭黑曲霉、棒曲霉和斋藤曲霉，也能大虽分泌柠檬酸。但是目前用于工业化的生产菌种几乎都是黑曲霉。以石油、乙酸、乙醇等为原料时，似乎都是酵母才能作为柠檬酸的生产菌株：如解脂假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等假丝酵母，以及毕赤酵母、汉逊酵母和红酵母属菌种也都能发酵正烷烃产生柠檬酸。但是酵母利用石油原料生产柠檬酸时几乎无一例外地伴随着产生相当数量的异柠檬酸。除霉菌和酵母外，不少细菌，如节杆菌、诺卡苗、放线菌、毛霉、木霉等也能产生少量柠檬酸。,一、柠檬酸发酵微生物,59,在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐。菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。,1)黑曲霉（Aspergillusniger）的形态特征 目前生产上常用产酸能力强的黑曲霉作为生产菌。,60,菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。对紫外线以及臭氧的耐性强。菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞真菌。分生孢子梗由特化了的厚壁而膨大的菌丝细胞（足细胞）上垂直生出；分生孢子头状如“菊花”。,61,2)黑曲霉（Aspergillusniger）的生理特征黑曲霉生产菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麦芽糖、糊精、乳糖等培养基上生长、产酸。黑曲霉生长最适pH值因菌种而异，一般为pH37；产酸最适pH为1.82.5。生长最适温度为3337，产酸最适温度在2837，温度过高易形成杂酸，斜面培养要求在麦芽汁4Be左右的培养基上。,62,黑曲霉以无性生殖的形式繁殖，具有多种活力较强的酶系，能利用淀粉类物质，并且对蛋白质、单宁、纤维素、果胶等具有一定的分解能力。,无性繁殖阶段；菌丝体（营养体）在适宜的条件下产生无性孢子，无性孢子萌发形成新的菌丝体，多次重复。,63,3)黑曲霉（Aspergillusniger）的分离,柠檬酸生产菌土壤和腐败的植物材料产酸能力强，耐柠檬酸浓度高酸性滤纸法（薯干粉，柠檬酸，土壤水稀释）指示剂法（溴甲酚绿，变黄）,64,黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。,65,一般高产：柠檬酸的菌株都具有一定的生理或形态特征。对于黑曲霉其主要特征有：在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性-淀粉酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部分活力；能耐高浓度柠檬酸，但不能利用和分解柠檬酸；能抗微量金属离子，特别是抗Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+等金属离子；在摇瓶和深层液体培养时能产生大量细小的菌丝球；具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或少产生ATP,66,4)黑曲霉（Aspergillusniger）的保藏,短期-麦芽汁琼脂-3-4月中期-孢子悬浮液-安培瓶-1-5年长期-冻干-23年,67,5）菌种退化与复壮,菌种退化：指生产能力的下降，但有时也伴随产孢子能力、抗粗放环境等能力的下降。退化症状：（1）在扩大培养是生长微弱或过度旺盛，产孢子能力下降或丧失（2）在发酵培养基和操作条件确信无异常的情况下，产酸能力普遍下降。（3）发酵液粘度可能升高，菌丝球形态、大小变化。（4）菌落大小有差别，或异常，甚至产孢子能力、颜色有变化。How？少传代，定期分离纯化-诱变，驯化,68,二、柠檬酸发酵机理,关于柠檬酸发酵的机制有多种理论，目前大多数学者认为它与三羧酸循环有密切的关系。糖经糖酵解途径(EMP途径)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脱羧形成C2化合物，两者缩合形成柠檬酸。,69,TCA Cycle,草酰乙酸,柠檬酸,异柠檬酸,琥珀酰辅酶A,琥珀酸,延胡索酸,苹果酸,乙酰辅酶A,a-酮戊二酸,70,草酰乙酸的补充途径,草酰乙酸的浓度对TCA 循环的正常进行至关重要，草酰乙酸可由下列三种途径补充。,磷酸丙酮酸羧化酶,丙酮酸羧化酶,苹果酸酶,苹果酸脱氢酶,71,淀粉,葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,磷酸丙糖,磷酸烯醇丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,苹果酸,草酰乙酸,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,琥珀酸,富马酸,CO2,Fe,2+,CO2,CO2,72,柠檬酸的溢出代谢：多种微生物均能因受刺激而过量合成柠檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境条件下代谢途径前段的运转速率大于后段的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉特有的遗传和生化机制与培养条件共同起作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以下三个方面：,73,高水平的柠檬酸合成能力。这个能力由3个因素构成。第一:是在有高浓度草酰乙酸（OAA）的情况下对 AcCoA 具有高度亲和力的组成型的柠檬酸合成酶（CS）的存在；第二:是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；,74,第三:是在缺少锰的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造成的铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的分泌，降低其胞内浓度。,75,淀粉,葡萄糖,6-磷酸果糖,1，6-二磷酸果糖,磷酸丙糖,磷酸烯醇丙酮酸,丙酮酸,乙酰CoA,草酰乙酸,柠檬酸,CO2,CO2,CO2,NH4,+,Pi,K,+,AMP,ATP,76,较低的降解柠檬酸的能力。这能力由两个因素构成。第一是低水平的-酮戊二酸脱氢酶（KD）影响TCA环运行的畅通程度，使TCA环前半部的中间产物积压；第二，在锰缺乏的条件下，顺乌头酸酶（AE）和 异柠檬酸脱氢酶（ID）的活性降低，从而使柠檬酸的累积比其它几种酸（顺乌头酸、异柠檬酸和-酮戊二酸）更明显。,77,在柠檬酸过量合成阶段，培养基的 pH 值显然会影响细胞膜对目的产物柠檬酸的跨膜输送；柠檬酸的分泌也会影响培养基的 pH值。锰与铁的缺乏有利于柠檬酸的排出。,78,黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出,79,TCA循环在柠檬酸积累中的调节,1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键；2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或极微弱;3)TCA循环的阻断或微弱(即顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶活力降低)，导致柠檬酸积累。而且，当柠檬酸浓度超过一定水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。,80,回补途径,TCA循环重要功能除产能外，为一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中间产物；生物合成中所消耗的中间产物若得不到补充，循环就会中断；回补方式：通过某些化合物的CO2固定作用，一些转氨基酶所催化的反应也能合成草酰乙酸和-酮戊二酸，通过乙醛酸循环,81,通过某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循环的中间产物得到回补：丙酮酸羧化酶：CO2+丙酮酸+ATP+H2O Mg+草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:CO2+PEP+H2O 草酰乙酸+H3PO4苹果酸酶:CO2+丙酮酸+NADPH+H+苹果酸+NADP+,为了能够在己糖或戊糖的中间代谢物上进行好氧生长，异养微生物至少要具备上述几种酶之种的一个酶。,CO2固定作用补充TCA环的中间产物,82,83,转氨基作用,定义：-氨基酸的氨基通过酶的催化,转移到-酮酸 的酮基上,生成相应的氨基酸;原来的-氨基酸则转变成相应的-酮酸。,R1CHNH2+COOH,R2C=OCOOH,R1C=O+COOH,R2CHNH2 COOH,转氨酶,84,转氨基作用几点说明：,（1）可逆反应，（2）转氨酶的辅酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的转氨酶：丙氨酸转移酶（ALT）/谷丙转氨酶（GPT）天冬氨酸转移酶（AST）/谷草转氨酶(GOT)ALT常用于肝疾患（肝炎等）辅助诊断、AST 用于心肌疾患（心肌梗塞等的辅助诊断）,85,CH3 H-C-NH2+COOH,COOH（CH2）2 C=O COOH,丙氨酸-酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸,ALT：谷丙转氨酶，急性肝炎时血清ALT 活性显著增高。,ALT,CH3 C=O+COOH,COOH（CH2）2 H-C-NH2 COOH,86,COOH CH2+H-C-NH2 COOH,COOH（CH2）2 C=O COOH,AST,天冬氨酸-酮戊二酸 草酰乙酸 谷氨酸,AST：谷草转氨酶，心肌梗塞时血清含量明显增高.,COOH CH2+C=O COOH,COOH（CH2）2 H-C-NH2 COOH,87,乙醛酸循环,88,乙醛酸循环,能够利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸转变为乙酰CoA；然后在异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶的作用下进入乙醛酸循环。乙醛酸循环的主要反应：异柠檬酸 琥珀酸+乙醛酸 乙醛酸+乙酸 苹果酸 琥珀酸+乙酸 异柠檬酸 净反应：2乙酸 苹果酸,89,柠檬酸发酵机理,柠檬酸的发酵机理可概括为：大量的胞内NH4+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的代谢得到加强葡萄糖经EMP通路分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物作用下氧化成为乙酰CoA及CO2，然后在柠檬酸合成酶作用下与草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受到抑制，而使柠檬酸得以积累。,90,按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。,91,三、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制追求柠檬酸的高产率,柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？,92,1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节,从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK 是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+浓度是如何升高的呢？,在正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是 还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1,93,1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节,研究表明，柠檬酸产生菌黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。,94,Mn+缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？,当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：,95,2.顺乌头酸酶活性的控制,该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢反应器，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。,随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活(顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活)，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。,96,顺乌头酸酶的活性：从理论上推测，顺乌头酸酶失活，三羧酸循环阻断是累积柠檬酸的必要条件。许多实验指出顺乌头酸酶活力变化与柠檬酸累积有密切关系。例如，产酸菌株的顺乌头酸酶活力比非产酸菌株低，产酸期比生长期低，生长在产酸培养基上菌株的顺乌头酸酶活比生长在非产酸培养基上的低。添加顺乌头酸酶抑制剂可促进柠檬酸积累。铁为顺乌头酸酶的激活剂，用亚铁氰化钾除铁，可以握高柠檬酸产率。,97,那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：，是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？,98,菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？,3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响,99,如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。,100,柠檬酸产生菌可在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。,101,解偶联剂（uncoupler）?,使氧化和磷酸化脱偶联，氧化仍可以进行，而磷酸化不能进行，解偶联剂为离子载体或通道，能增大线粒体内膜对H+的通透性，消除H+梯度，因而无ATP生成，使氧化释放出来的能量全部以热的形式散发。动物棕色脂肪组织和肌肉线粒体中有独特的解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCPs)，与维持体温有关。常用解偶联剂主要有：质子载体：2，4-二硝基酚(DNP，图)，羰基-氰-对-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。质子通道：增温素（thermogenin）。其它离子载体：如缬氨霉素。某些药物：如过量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶联，从而使体温升高。,102,实验证明，在某些微生物体内确实存在侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如在柠檬酸的发酵中，发酵液的溶氧浓度在很低水平维持一段时间，或中断供氧一段时间（20分钟），则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体。标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。,103,理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。科学研究过程中的许多基本规律是相同的，今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设,104,能量平衡,EMP中底物水平磷酸化,2ATP,EMP途径,2NADH,丙酮酸氧化脱羧,2NADH,可以满足生产菌的维持能量消耗，不需要消耗C源经TCA来产能,105,黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。,CO2固定反应,106,通过 CO2固定反应提供C4二羧酸（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2=草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶 以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。,107,柠檬酸发酵中，三个控制点,108,第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK）,柠檬酸和ATP对该酶有抑制,生产菌需要解除该抑制作用,AMP、无机磷以及NH4+对该酶有活化作用,NH4+有效解除柠檬酸和ATP对该酶有抑制，故生产上通过添加铵盐来提高柠檬酸产量,Mn2+的影响：,Mn2+缺乏,菌体的TCA酶活下降,Mn2+缺乏,可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解,NH4+水平升高,减少柠檬酸对该酶的抑制,109,第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应,110,顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。,111,为什么在A.nigar中异柠檬酸不会进一步分解及柠檬酸的积累机制？黑曲霉乌头酸水合酶存在于线粒体中，它催化的反应存在着柠檬酸：异柠檬酸：顺式乌头酸=90：7：3的平衡关系；黑曲霉对辅酶NAD+专一性的异柠檬酸脱氢酶活力很低，却有三种依赖于辅酶NADP+的异柠檬酸脱氢酶，其中的两种与存在于线粒体的酶及TCA循环有关，它们受到生理浓度柠檬酸的抑制。,112,-酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。,-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。-酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。,113,氧对柠檬酸积累的调节,乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：,(1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。,当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。,114,柠檬酸生物合成途径,115,柠檬酸的积累机制总结,1)由于Mn2缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4浓度升高和有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因分别解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；,116,2)由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，就源源不断地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脱酸生成乙酰-CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。,117,柠檬酸的积累机制总结,3)顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡：柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸9037；4)控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，使柠檬酸积累；5)一旦柠檬酸浓度升高到某一水平就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进了柠檬酸自身积累；6)柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。,118,柠檬酸积累的理想条件：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高柠檬酸合成酶的活性4、抑制顺乌头酸酶的活性5、抑制异柠檬酸脱氢酶的活性6、抑制-酮戊二酸脱氢酶的活性7、抑制异柠檬酸裂解酶的活性,119,柠檬酸发酵需要下述环境条件,(1)磷酸盐浓度低；(2)氮源用NH4+盐；(3)pH值低（3.0）；(4)溶氧量高；(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。,120,1、无CO2固定反应的产率,合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A，也就是需要1.5分子的葡萄糖。,理论产率为：192/(1801.5)=71.1%,柠檬酸发酵的产率,生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸,121,2、通过 CO2固定反应提供C4二羧酸,122,第六节 黑曲霉生长和发酵条件,柠檬酸发酵菌体代谢失调 来源于 环境条件 营养条件 细胞化学组成、结构 酶系,123,一、黑曲霉细胞化学组成,水分 黑曲霉细胞含水较多，85-90%碳水化合物 1，4聚乙酰葡聚糖胺聚乙酰半乳糖胺含氮化合物 脂类 与Mn的关系有机酸、多元醇,124,二、黑曲霉酶系,柠檬酸合成酶系淀粉水解酶系蛋白酶葡萄糖氧化酶脂肪酶类果胶酶。,125,三、营养条件,被动扩散高浓度向低浓度（浓度差）主动扩散可逆浓度差进行（蛋白质载体、酶类）,126,柠檬酸生产工