动物细胞融合课件.ppt
第十章动物细胞融合,细胞融合机理,单克隆抗体的大规模生产,单克隆抗体技术,细胞融合的基础知识,第一节 细胞融合的基础知识,细胞融合（cell fusion）：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为自发细胞融合和诱导细胞融合。,细胞杂交（cell hybridization）：指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。所得到的融合细胞叫杂交细胞。,融合指数（fusion index,FI）：指细胞融合的效率。1 反映融合实验中多核细胞的出现频率。FI=（对照组细胞数-实验组细胞数）/实验组细胞数2 反映融合实验中多核细胞的细胞核数出现频率。FI=多核细胞的细胞核数/所有细胞的细胞核数,一 自发细胞融合,自发细胞融合（spontaneous cell fusion）：指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。,体内细胞的自发融合 可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。,体外细胞的自发融合小鼠和鸡成肌细胞的融合：可在原代培养中观察到，只有处于 G1期的成肌细胞才能彼此发生融合。肿瘤细胞的融合：体外培养的肿瘤细胞和体内一样彼此发生融合,二 诱导细胞融合,诱导细胞融合（induced cell fusion）：指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。,人工诱导形成的融合细胞有两类：同核体：由同一亲本细胞融合而来。异核体：由不同亲本细胞融合而来。,三 细胞融合技术,细胞融合技术研究细胞间遗传信息转移、基因在染色体的定位以及创造新细胞株的有效途径。细胞融合技术的主要过程：1、制备亲本细胞；2、诱导细胞融合；3、筛选杂合细胞。,细胞融合的主要过程：细胞在诱导剂或正弦电场作用下凝聚，彼此靠近；两个相邻细胞之间的质膜相互融合；质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等质膜成分在融合后的质膜上重新分布；细胞质发生融合；细胞核融合，形成单核融合细胞。,植物细胞融合与人造小鼠培育过程,1.亲本细胞的制备,两种完整细胞融合转移的整套染色体组、核外DNA和 细胞质因子。亲本细胞可以是两个完整细胞；亲本细胞可以是胞质体和核体胞质体（无核细胞）：由绝大多数细胞质组成，外面包有细胞膜的结构。核体(小型细胞)：含有完整细胞核，外面包有细胞膜和少量细胞质的结构。将细胞接种到塑料培养皿上，加入一定量的细胞松弛素B（CB）处理，将培养皿中长有细胞的一面朝下置于离心管中离心，可分开胞质体和核体。胞质体和核体单独存活的时间不超过2小时。,亲本细胞可以是微细胞含有几条甚至一条染色体的微核，外面包有细胞膜和少量细胞质的结构。动物细胞经秋水仙素处理后，再经CB处理和离心作用形成。微细胞与核体不同，微细胞含有微核；核体含有完整细胞核。,2.诱导细胞融合,人工诱导细胞融合的方法：病毒诱导：灭活的仙台病毒化学诱导：PEP、Ca2+、溶血卵磷脂等物理诱导：电诱导,3.筛选杂合细胞,细胞融合后，存在5类种型的细胞：异核体（双核或多核）、两种同核体(双核或多核)以及未发生融合的两种亲本细胞。筛选的基本原理是把杂合体从同核体以及未发生融合的两种亲本细胞中分离出来。,筛选的方法非选择性筛选：利用杂交细胞生长比亲本细胞快的现象，用机械的方法（如毛细管吸取法）把单个杂交细胞挑选出来，分裂繁殖，培养出细胞克隆。所以也称为单细胞克隆。选择性筛选：根据细胞对药物的抗性、营养要求或温度敏感性等的不同，选择适当的培养条件，将杂交细胞分离出来。常用方法有：抗药性筛选；营养陷型筛选；温度敏感型筛选等。,第二节 单克隆抗体技术,1975年，英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。,单克隆抗体技术（杂交瘤技术）,单克隆抗体：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子。从一个单克隆细胞产生的抗体分子，即称为单克隆抗体，其具有独特的均一结构。,原理：正常淋巴细胞在体外无法培养成功（淋巴细胞）。多发性骨髓瘤疾病中的B细胞肿瘤，在浆细胞中发生了在成瘤转化而产生免疫球蛋白，并能在体外生长易被克隆。,单克隆抗体技术,单克隆抗体制备流程：用特异抗原免疫实验动物取含大量B细胞的脾细胞 鼠骨髓瘤细胞 细胞融合 筛选杂交瘤细胞 生产单克隆抗体,杂交瘤技术过程,一 亲本的选择,B 淋巴细胞经特定抗原免疫的能产生目的抗体的动物淋巴细胞；免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近的亲源关系。如：鼠鼠杂交瘤细胞；人鼠或鼠兔杂交瘤细胞不稳定。,一般要经过初次免疫、第二次免疫(向动物腹腔内注射抗体)、加强免疫(向动物静脉内注射抗体)三个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。,骨髓瘤细胞的获得与培养,骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。,骨髓瘤细胞：不能马上使用，需同时具有两个独特的性质：骨髓瘤细胞系不能分泌抗体，否则杂交瘤细胞将分泌混合抗体；要选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）。,二 杂交瘤细胞建立的技术关键,亲本细胞的准备1、致敏B淋巴细胞的准备 材料：8周龄的BALB/C系小白鼠，少数用Lou系大鼠；方法：腹腔注射，0.5ml/次 3-4天一次共3-4周；皮下注射，0.1ml/次；杀死前3天进行一次加强注射（静脉）；目的抗原：各种病毒，细菌，癌细胞等；病毒抗原（lmg/mlPSS）：福氏完全佐剂（Freund）1:1等量混合制成乳剂。加强注射：可在抗原乳剂中加入细菌脂多糖（LPS），促进淋巴细胞转化，提高脾细胞分泌抗体的能力 抗体效价检查：如果检查抗体效价低，可进行多次加强免疫。制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。,亲本细胞的准备杂交瘤细胞,2、骨髓瘤细胞 要选择与B淋巴细胞来源相同的代谢缺陷型(GPRT-或-)克隆形成率达到80%以上。取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。,杂交细胞融合,将骨髓细胞：脾细胞按1:41:10，一般为1:5混合，并加入PEG诱导细胞融合，混合时间在min内。30秒内加入预热的一定浓度、一定分子量的PEG，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培养。细胞分装：混合细胞中加入HAT培养液，浓度为105细胞/0.1ml培养基，-6天出现新细胞克隆。,骨髓瘤细胞淋巴细胞,没融合的淋巴细胞6-10天死亡,杂交瘤细胞,没融合的骨髓细胞如何选择？,三 融合细胞的筛选,培养基的选择,HAT培养基：在培养液中加入次黄嘌呤（）、氨基喋呤（）及胸腺嘧啶脱氧核苷（）。培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。,筛选原理,DNA的合成：正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA，可以被氨基蝶呤阻断。胸腺嘧啶核苷激酶（TK）补救途径：核苷酸前体 核苷酸DNA 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）,氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。融合所用的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。,利用HAT 培养基 选择的基础,二氢叶酸 FH2,甘氨酸 Gly,四氢叶酸FH4,天冬氨酸Asp,DNA,dGTP dATP,dTTP,次黄嘌呤核苷酸HMP,次黄嘌呤 H,胸腺嘧啶T,HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤 转磷酸核糖激酶),氨基喋呤(A),TK（胸腺嘧啶核苷激酶）,四 分泌抗体的融合细胞的筛选 ELISA方法检测抗体,杂交瘤抗体检测 抗原结合法 第二抗体法,克隆选择 有限稀法 个0.2ml 软琼脂法 0.5%琼脂，个细胞0.2ml,将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。,第三节单克隆抗体的大量生产,1）实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按13107cellsml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。采血量有限。,2）腹水制备法,腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法。,3）单克隆抗体的大规模生产-生物反应器,抗体效价可达10100 mg/ml。如：美国Damon公司申请专利中空微球体（微末）技术，0.11g抗体/L培养基.不为其他免疫球蛋白污染。有一定纯度。用无血清培养基；纯化用硫酸铵沉淀，DEAE为介质在离子交换层析柱上提纯。,使用单克隆抗体的风险（不能含病毒）多数哺乳动物细胞在它们的染色体中含有逆转录病毒的遗传信息；（纯系）鼠细胞常释放病毒逆转录病毒；有关管理部门规定：除非单克隆抗体和杂交瘤无病毒，否则不能批准；美国FDA发现鼠源杂交瘤细胞产生的单抗潜在污染的病毒：腺病毒、胸腺病毒、脑脊髓炎心脏炎病毒、脑脊髓炎病毒、呼吸肠道病毒、出血热病毒、肝炎病毒、缺肢畸胎病毒、多形瘤等。,生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗,杂交瘤细胞：WuT3杂交瘤细胞 生物反应器：采用3.5升、14升、75升搅拌式生物反应器，具有自动消毒、控制温度、转速、DO和pH等功能。培养液：RPMI1640中添加庆大霉素至100单位、胎牛血清（NcS）或健康人血清（HuS）、添加剂HEN（蛋白胨和糖类）。,培养方式,控制温度在37、pH7.1、转速40-60r/min、DO在30-50%，分批和半连续培养。离心机除去细胞，收集上清液用于单抗浓度、免疫活性、热原等分析测定。,3.5升搅拌式生物反应器分批培养，WuT3杂交瘤细胞经48小时适应期后进入对数生长期，维持24小时后进入平衡期，这一阶段持续约48小时，分泌单抗。继续放大至75升生物反应器，半连续生产，细胞浓度达到1.5106/ml，单抗产量为50-70g/ml。这样每间隔2天收获1批，获得上清液40升，平均日产单抗达1克。,抗体工程,动物抗原的不足：例如虽然可以识别抗原却不能激活补体系统，常被人免疫系统识别产生人抗鼠抗体或激发免疫反应，易被清除等。抗体修饰与人源化抗体：例如将人抗体恒定区与鼠可变区拼接。,单克隆抗体的应用,提高免疫分析或其他新分析的灵敏度和重复性 组织相容性抗原、互补成分、血液凝固、血型抗原、干扰素、雌激素、精子抗原、黄体酮、人生长激素、血细胞介素、促胃液素诊断 性传播疾病、血型、怀孕或排卵、癌（早期癌抗原的检测）治疗 药过剂量的校正、减少由骨髓移植带来的危险、检测癌转移、治疗癌症（直接地或定向细胞毒药物）、糖尿病。,T细胞杂交瘤 淋巴细胞活素T细胞生产：免疫干扰素、巨细胞激活因子、白细胞介素1.2、集落刺激因子（CSF）、B细胞分化因子（BCDF）。,小结,细胞融合的定义、原理与方法融合细胞的筛选方法：杂交瘤细胞的筛选方法单克隆抗体的制备方法,
