双光子荧光概述课件.ppt
双光子荧光（Two-photon fluorescence）,组员：樊艳萍 孟 筝 贾晓波 白秋红 2015.10.22,目 录,1.研究背景2.基本原理 3.特点及优点4.应 用,1 双光子荧光背景介绍,双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。早在1931年,Gppert Mayer 就在理论上预言了双光子吸收的存在。直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制,使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。,1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微和成像这个崭新的领域。,近年来,有机双光子吸收材料在诸多领域,尤其是双光子荧光显微和成像中的应用得到了广泛的关注。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应用,包括单分子检测、免疫测定、DNA片断测定、化学和生物传感器、生物微芯片、毛细管分离检测等。在大量的实验和理论研究基础上,人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构-性能关系,提出了许多行之有效的设计及合成策略,大大推动了双光子吸收应用的发展。,2 双光子荧光基本原理,2.1 单、双光子荧光的介绍在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个荧光光子，就是单光子荧光。,与单光子相比，双光子激发过程就是基态荧光分子或原子同时吸收两个光子激发至激发态，通过弛豫过程，辐射出频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。比如对NADH酶，在单光子激发情形下，需在350 nm的光激发下产生450nm 的荧光。而在双光子激发情形下，可采用光损伤较小的红外或近红外光，如700nm 的激光来激发得到的450 nm荧光。,2.2 双光子吸收的示意图,图(a)为单光子激发过程。在激光照射下，基态分子或原子吸收一个光子后成为激发态，随后又弛豫到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光。这一过程就是单光子激发。当使用光波长为图(a)中激发光波长两倍的光，对相同物质进行激发时，由于所使用光波的光子能量仅为原来的一半，无法通过单光子过程使基态电子激发到激发态。只有在光子密度极高的情况下，基态的电子可以同时吸收两个光子，使处于基态的电子跃迁至激发态，这种现象如图(b)所示。,图2a 双光子吸收 图2b 单光子吸收 S 单重态能级 T 三重态能级V 虚拟中间态 hv 吸收光能量Fl 荧光 Ph 磷光 系间窜越,荧光物质在吸收了与其能级结构匹配的能量后，电子由基态S0被激发至激发态S1，经过辐射跃迁后电子又回到基态S0，这一过程中发射出荧光。与单光子荧光不同，双光子吸收过程中，基态与激发态之间存在一个虚能态,通过两个光子的能量进行叠加而使处于基态的电子达到激发态。,双光子荧光产生原理：荧光分子吸收第一个光子后，跃迁到虚能级上，该能级仅能存在几飞秒，便自动返回基态，第二个光子必须在这几飞秒内与虚能级上的分子作用，从基态跃迁到激发态，能量较大的激发态分子,通过内转换使自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于此能级的分子不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同的振动能级时，就发射荧光。,3 双光子荧光的特点及优点,3.1 特点：(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区(800nm)；(2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；,3.2 优点,(1)由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性较好；,3.2 优点,(2)双光子荧光使用红外激光作为激发光源，能大大地降低生物组织对激发光的吸收，可获得较强的样品荧光；,3.2 优点,(3)长波长光源作为双光子荧光的激发光源，可以避免样品中激发波长较低的自发荧光物质的干扰；,3.2 优点,(4)双光子荧光可以避免普通荧光成像中的荧光漂白问题和对生物细胞的光致毒问题；,3.2 优点,(5)双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些特殊物质进行成像研究，广泛应用于生物活体检测中。,4 双光子荧光应用,双光子荧光探针双光子荧光显微成像,双光子荧光探针设计原理,探针分子组成：一是荧光团；二是离子团或称作受体作用机制：1、一是分子内电荷迁移机理（ICT）2、二是光诱导电子迁移过程（PET）3、共振能量迁移(RET)4、集团转换（GC）,双光子荧光探针的种类,阳离子探针 镁离子探针，由pond等在2004年合成，这些探针对离子的选择性差，在水中不能络合镁离子 钙离子探针，由Kim等在2004年合成,是ICT探针，在水中不能络合钙离子，不能用于荧光显微镜 基于ICT铅离子探针，由Ahn在2005年合成，锌离子有干扰作用，不能在水中应用 基于RET铅离子探针，探针络合了铅离子后，荧光增强5倍，探针的选择性比较好，唯一的干扰是铝离子。但由于水溶性差，不能在水中络合铅离子。,双光子荧光探针的种类,阴离子探针 氟离子探针，Liu等报道了3个类似的探针分子。此类探针尚不能在水中识别氟离子但为双光子阴离子探针的设计提供了一个范例。双光子pH探针 werts等合成了双光子pH探针，是唯一成功用于双光子显微镜的双光子探针。,双光子荧光探针的研究领域,双光子葡萄糖示踪器 具有良好的光稳定性，能够持续监控正常细胞与结肠癌细胞摄入葡萄糖的过程，能够成像观察癌细胞与结肠癌深处抗癌剂的能力，为癌症的早期诊断提供帮助双光子巯基探针 根据探针与巯基反应后荧光增强，可用双光子显微镜探测活体细胞与组织90-180m深处的巯基成像情况双光子半胱氨酸探针 根据醛基（sp2）与半胱氨酸反应后转变为叔甲基(sp3)而丧失吸电子效应这一原理实现双光子生物标记探针 可用于生物免疫荧光标记，具有很好的灵敏性,双光子荧光探针的研究领域,可研究离子的含量及其对生理的影响离子参与的生理活动机制离子与分子的作用特定分子的分布及其相互作用等这对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义,双光子诱导发射荧光(TPF)探针线粒体成像,3-（1-羟乙基-4-烯基吡啶碘盐）-N-正丁基咔唑（9B-HVC）水溶液中本质上是非荧光的，仅仅在线粒体环境中积累就会发出荧光。9B-HVC是一种潜在的线粒体双光子荧光探针。,9B-HVC,MTO,合并,双光子荧光显微成像,双光子荧光显微镜：双光子荧光显微镜通过对样品在双光子激发后发出的荧光进行探测，实现样品的三维成像。可以对生物样品实时在体监测，已成为研究细胞结构和功能检测的重要工具。,双光子共焦激光扫描荧光显微镜,是以光学系统的共焦成像为基础,利用光扫描技术和样品扫描技术对样品进行三维动态测量的装置.共焦小孔的存在,探测器只接收来自物镜焦点处的信息,焦点以外的光将全被共焦小孔屏蔽,双光子共焦激光扫描荧光显微镜的应用,双光子共焦激光扫描荧光显微镜的应用,利用双光子微细加工方法得到的三维微细结构图,双光子荧光显微图像,通过双光子显微镜拍摄的真皮图像 绿色：胶原蛋白 红色：弹性蛋白,双光子近红外荧光成像图,双光子吸收在微纳米加工中的应用,世界上最小的动物模型：纳米牛,世界上最小的微纳机械,Appl Phys Lett,2001,78(2):249251,双光子吸收在微纳米加工中的应用,The fly(苍蝇)Cite this:J.Mater.Chem.,2011,21,5650,双光子吸收在微纳米加工中的应用,多焦点阵列加工技术,Appl Phys Lett,2007,91(12):124103,谢谢观赏！,
