微生物学第九章感染与免疫课件.ppt

,章传染与免疫InfectionandImmunity节传染与传染病节免疫节抗原与抗体,第一节 传染与传染病,一、传染（infection）：又称感染病原微生物侵入机体后，在一定的部位生长、繁殖，从而引起一系列病理生理的过程。由于机体的抵抗力和病原菌两方面的力量不同以及环境因素的影响，有时不表现临床症状，成为隐性传染或带菌状态，有时表现出临床症状传染病。二、传染病（infectious disease）可从一个宿主个体直接或间接传播到另一宿主个体的疾病。决定传染结局的三大因素：病原体；宿主的免疫力；环境因素。,三、病原微生物的致病性 1、细菌：毒力(virulence)：某种微生物对一定宿主，在一定条件下引起疾病的能力，亦称为致病性(pathogenicity)。强弱取决于侵袭力和毒素。侵袭力（invasiveness）：病原菌突破宿主防线，并能在宿主内定居、繁殖和扩散的能力。与酶（卵磷脂酶、透明质酸酶、胶原酶、链激酶、凝固酶）和微生物结构（荚膜、菌毛、表面抗原）有关。毒素（toxin）：根据性质、来源和作用分为外毒素和内毒素。,外毒素（exotoxin）:病原菌生长过程中不断向外界环境分泌的一类毒性蛋白。毒性强，可选择性地作用于各自特定的组织器官，抗原性强，毒性不稳定（对热和化学物质敏感）；0.30.4%甲醛脱毒，成为类毒素（仍保持抗原性）。如肉毒毒素、破伤风痉挛毒素、白喉毒素等。内毒素（endotoxin）：是G-菌细胞壁外层的组分之一，化学成分为脂多糖（LPS），一般不分泌到环境中。毒性低，没有器官特异性，抗原性弱，化学稳定性强。,2、病毒病毒在宿主细胞内增殖,影响宿主细胞的核酸和蛋白质代谢，产生3种类型的后果：第一种：杀细胞感染，如脊髓灰质炎病毒、腺病毒等。第二种：稳定状态感染，病毒与细胞并存、繁殖、传递给子细胞，不引起细胞死亡，但在增殖过程中引起宿主细胞膜组分改变而诱发自身免疫反应，造成对宿主的免疫损伤，如甲肝病毒等。第三种：整合感染，整合于宿主细胞染色体或以质粒形式存在，不增殖，但长期潜伏，可引起恶性肿瘤，如人类多瘤病毒、人类逆转录病毒等。,3、真菌：（1）致病性真菌：主要是外源性真菌引起的皮肤、皮下和全身性病害，如手足癣等。（2）条件致病性真菌：主要是一些内源性真菌在机体免疫力降低的情况下，引起皮肤病、肺炎、食道炎、膀胱炎、脑膜炎等。（3）真菌变态反应性疾病：真菌本身不致病，但引起变态反应性疾病，如曲霉、青霉等引起的哮喘、鼻炎等。（4）真菌性中毒：有些真菌产生毒素，引起疾病，但与细菌病毒感染不同，没有传染性，有明显的地区性和季节性。,第二节 免 疫,一、免疫：传统上，免疫是指动物机体对微生物侵染的抵抗力和对同种微生物再感染的特异性防御能力。后发现，很多现象如器官移植排斥反应、过敏反应等与病原微生物感染并无关系。因此，人们把生物体能够辨认自我与非我、对非我作出反应以保持自身稳定的功能称为免疫。现代免疫的概念具有了更为广泛的意义和更为复杂的内涵。免疫系统是由免疫组织和器官、免疫细胞及免疫活性分子等组成。免疫细胞对病原体或肿瘤细胞的适当应答，使之清除，执行免疫防卫功能。另一方面，免疫细胞的不适当应答，或应答过高，会致过敏性疾病；或应答过低，易致严重感染，对自身组织发生应答，导致自身免疫病，均会对生物机体有害。,免疫反应分类：（1）非特异性免疫与特异性免疫 非特异性免疫是机体对所有病原微生物都有防御作用，没有特殊的选择性。它受遗传控制，是机体在长期的种系发育与进化过程中逐渐建立起来的一系列防卫机能，在个体一出生就具有。又称天然免疫（先天免疫）特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或其产物所产生的特异性抗力。是个体在生活过程中通过隐性感染或预防接种等方式，使抗原与免疫系统的细胞相接触后而获得的防卫机能。又称后天获得性免疫,（2）自动免疫与被动免疫 自动免疫是指用人工方法注射抗原（菌苗、疫苗、类毒素），使机体产生免疫功能。被动免疫是指用人工方法注射抗体（抗毒素、抗血清）而产生对病原体的抵抗力。（3）细胞免疫与体液免疫 细胞免疫是指致敏淋巴细胞与其相应抗原作用所产生的特异性免疫。体液免疫是抗体的免疫作用。,二、免疫学（Immunology）,即是研究免疫系统的结构与功能，探索其对机体有益的防卫功能和有害的病理作用及其机制的科学。可用以发展有效的免疫学措施，实现动物和人类的防病、治病。实际上免疫学理论和方法已经扩展到化学分析、分子生物学、生物传感器等诸多学科和领域。,三、免疫的基本特性,免疫可识别自身与非自身：动物的免疫系统，能够识别自身与非自身的大分子物质，是机体免疫应答的物质基础；,免疫具有特异性：免疫系统的免疫应答和由此产生的免疫物质具有高度的特异性，即具有很强的针对性；,免疫具有记忆性：机体对某种外源物质（抗原）的免疫应答产生的抗体经过一段时间后会逐渐消失，但免疫系统仍然保留对该抗原的免疫记忆，若同一外源物质再次侵入机体时，机体会会迅速产生较上次侵入时更多的抗体，这种现象称为免疫记忆现象。,三、免疫的基本功能,动物机体的免疫具有三项基本功能：,免疫防御功能，即机体对由消化道、呼吸道、皮肤、粘膜等途径进入体内的病原体的抵抗力，通过机体的特异性或非特异性免疫杀死病原体；,免疫稳定：免疫的第二个重要功能是把新陈代谢中衰老和死亡细胞清除出体内，以维护机体的生理平衡；,免疫监视功能：清除自身突变细胞的功能称为免疫监视。,第 三 节抗原与抗体Antigen and Antibody,一、抗 原（一）基本知识,抗原(antigen)是一类能刺激机体免疫系统产生免疫应答(immune response)产物抗体(Antibody)或致敏淋巴细胞又能与之发生特异性结合的物质。具有一定的化学结构、物理及生物学特性，并具有免疫原性（抗原性）和反应原性。,抗原性（免疫原性）：刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的免疫应答能力称为抗原的抗原性(antigenicity)或称免疫原性(immunogenicity)。反应原性：抗原能和特异性抗体或致敏淋巴细胞结合，发生特异性反应的能力即是抗原的反应原性(reactionogenicity)。又称为免疫反应性,根据抗原的抗原性:完全抗原(complete antigen)：具有免疫原性和反应原性的抗原。如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素和一种动物血清等，称为完全抗原。半抗原(haptem)：只有反应原性，没有抗原性。很多小分子物质不能单独刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，但能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应，此类物质称半抗原。如青霉素类药物、药理活性肽类一些激素、嘌呤嘧啶碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、人工多聚核苷酸以及核酸大分子等物均为不完全抗原。这些分子量较小的半抗原物质与相应的载体蛋白(如甲基化牛血清蛋白，)结合为复合物后，就可各自通过实验手段诱发出高度特异的抗体，此种抗体可用于放射免疫测定或其他测定，可检出极微量的相应半抗原物质。,半抗原又可分为简单半抗原和复合半抗原。简单半抗原：又称阻抑半抗原，其分子量较小，既无免疫原性，也无反应原性，只有一个抗原决定簇，不能与相应的抗体发生可见的反应，但能中和相应的抗体，阻止了抗体在相应的完全抗原或复合半抗原发生可见的反应（用沉淀抑制反应可证实）。如抗菌素、酒石酸、苯甲酸等都属于这类抗原。复合半抗原：复合半抗原的分子量较大，有多个抗原决定簇一般的半抗原都属于此类，能与相应的抗体发生沉淀反应。二硝基氯苯、多糖类、脂质、脂多糖等都属于这类抗原。,（二）、抗原的性质（构成抗原的条件）,1)大分子物质：分子量通常在104Da以上。一般来说，分子量越大抗原性越强，低于4x 104Da的物质，一般不是抗原。2）一定的结构：除分子量外，抗原物质还要求有一定的化学组成和结构，且组成必须暴露在大分子的表面，抗原分子还需具有一定的空间构型。,3)特异性：由分子表面的特定化学基团所决定，此基团称抗原决定簇(antigenic determination cluster)（半抗原）。抗原的结合价(antigenic valence)凡能与抗体分子结合的抗原决定簇的数目。抗原决定簇（antigenic determinant）或称抗原表位(antigenic epitope)是位于抗原物质分子表面或者其他部位的具有一定组成和结构的特殊化学基团，它能与免疫系统中淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结合，它是免疫原引起机体特异性免疫应答和免疫原与抗体特异性反应的基本构成单位。,抗原决定簇决定着抗原的特异性，即决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。一般来讲，蛋白质抗原的38个氨基酸残基可以构成一个抗原决定簇，多糖抗原中的36个呋喃环可以构成一个抗原决定簇。抗原分子中直接由分子基团的一级结构序列决定的决定簇称为顺序决定簇(sequential determinants)或连续决定簇(continuous determinants)。抗原分子中由分子间特定的空间构象决定的决定簇称为构象决定簇(conformational determinants)或不连续决定簇(discontinuous determinants)。蛋白质抗原的顺序决定簇决定于肽链的氨基酸序列即肽链的一级结构，而构象决定簇决定于由这个一级结构折叠而成的空间构象。,4)异物性：指进入机体的抗原物质必须与机体的组织细胞与体液的成分有差别，差别越大，免疫原性越强。包括：1、异种间的物质：不同种之间的动物体成分有差异，可互为抗原。2、同种个体间的不同成分：同种动物的不同个体之间，相应的组织细胞成分也不同。3、自体内隔绝成分：固定在某一部位，与产生抗体的细胞相隔离的成分。4、其他自体组织蛋白：因理化因素的影响发生变性，成为自身抗原。,（三）、抗原的分类,根据抗原的不同来源可分为：,天然抗原天然抗原是指天然生物、细胞及天然产物。天然抗原又可具体分为组织抗原、细菌抗原、病毒抗原等；,人工合成抗原人工抗原是指人工化学改造后的抗原，例如半抗原经化学改造后就是人工抗原,合成抗原合成抗原是化学合成的具有抗原性质的分子，如氨基酸的聚合物等。,根据抗原与机体的亲缘关系又可分为：异种抗原、同种异型抗原 自身抗原,根据抗原的化学性质可分为：,蛋白质抗原,多糖抗原,脂抗原,核酸抗原，等,根据刺激机体细胞产生抗体是否需要细胞辅助又可分为：,胸腺依赖性抗原,非胸腺依赖性抗原。,绝大多数天然抗原属于前一种。,（四）、微生物的抗原结构,细菌、病毒、立克次氏体等都是很好的抗原，由它们刺激机体所产生的抗微生物抗体，一般都有保护机体不再受该微生物侵害的能力。微生物的各种化学成分如蛋白质及与蛋白质结合的各种多糖和脂类，都可能是抗原，并可产生各种相应的抗体。微生物的抗原结构是微生物分类的依据之一。,细菌的抗原：1、菌体抗原（somatic antigen)2、鞭毛抗原(flagella antigen)3、表面抗原(surface antigen)4、细菌毒素抗原（toxin antigen）,1、菌体抗原（somatic antigen)：一个细菌细胞含有多种抗原，是由不同蛋白质、多糖和脂类组成的复合抗原。不同种或不同型的细菌各有自己特有的菌体抗原，称为特异抗原，所产生的特异抗原只能与该种或该型的细菌发生反应。有些不同种或不同型之间有相同的抗原，称为类属抗原或共同抗原，它们所产生的类属抗原既能与产生这一抗体的该细菌发生反应，又能与含有相同抗原的其它种细菌发生反应，称为交叉反应。具有鞭毛的细菌在失去鞭毛后，不能形成云雾状菌落，德语中称为 Ohne Hauch，因此把那些丢失鞭毛后的菌体抗原，称为 O 抗原。,2、鞭毛抗原(flagella antigen)：具有鞭毛的细菌可形成云雾状菌落，德语中称为 Hauch，因此将鞭毛抗原命名为 H 抗原。,3、表面抗原(surface antigen)：包围在细菌菌体抗原外表的抗原，它的存在可干扰菌体抗原与相应抗体的结合。最先证实的细菌表面抗原是肺炎球菌的荚膜抗原，以后陆续发现伤寒杆菌的Vi抗原，大肠杆菌的K抗原等。,4、细菌毒素抗原（toxin antigen）：细菌毒素如外毒素是一类抗原性很强的蛋白质，进入人体和动物后可引起宿主产生抗体。类毒素是外毒素经甲醛脱毒后的蛋白质，对于动物已无毒，但仍具有良好免疫原性而仍是良好抗原。,二、抗 体,抗体(antibody，Ab)是机体在抗原物质的刺激下形成的一类能与抗原特异性结合的血清活性球蛋白，又称免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)，由B细胞（淋巴细胞）合成并分泌，主要存在于动物的血清、淋巴液、组织液及其它外分泌液中，因此将抗体介导的免疫称为体液免疫。,抗 体 特 性,抗体在体外可与相应的抗原特异结合而发生肉眼可见反应；抗体在体内如与病原微生物结合，起抗传染作用，如作用于自身组织细胞，使机体发生自身免疫性疾病。抗体存在于血清和其他体液如乳液及某些外分泌液中。,(一)、抗体的基本结构和分类,免疫球蛋白的种类很多，但其基本结构却相同。由四条多肽链组成，其中两条相同的长链叫重链（H链）,两条相同的短链叫做轻链（L链）。两条重链借二硫键连接起来，呈Y字形，两条轻链又通过二硫键连接在Y字的两侧，所以整个免疫球蛋白分子结构是对称的。,近对称轴的一对较长的链称为重链或链，重链的分子量约为5075kD，由450550个氨基酸残基组成。在对称轴较短的一对肽链称为轻链或链，轻链的分子量约25 kD，由214个氨基酸残基构成。IgG分子由3个相同大小的节段组成，位于上端的两个臂由易弯曲的铰链区（hinge region）连接到主干上形成一个“Y”形分子，称为Ig分子的单体，这是构成免疫球蛋白分子的基本单位。,根据肽链中氨基酸顺序是否恒定，将链和链分别分为恒定区域(C区)和可变区域区(V区)。Ig的V区端是肽链的氨基末端（N端），另一端为羧基末端（C端），链上的代表它的糖基。,免疫球蛋白的基本结构图,抗原结合位点,补体结合位点,Fc段受体结合位点Fc为结晶片段,抗体的种类,根据抗体的作用可将抗体分为：1）抗毒素抗体：由外毒素（或类毒素）刺激机体产生，由于它与相应外毒素结合后可中和其毒性，因而称为抗毒素抗体。2）抗菌抗体：机体针对细菌抗原所产生的抗体，当与相应细菌相遇时，彼此发生结合，在有电解质存在下细菌发生凝集，这类抗体称为抗菌抗体。3）抗病毒抗体：针对病毒抗原的抗体。4）亲细胞性抗体：能吸附在肥大细胞或嗜碱性细胞上，其类别为IgE,就抗体的理化及免疫学性状看，基本有五种,IgG,IgM,IgA,IgD 和 IgE 五种免疫球蛋白单体之间的区别在于重链 C 区的氨基酸组成和抗原性有所不同。,(二)、抗体的生理功能,1、识别并特异性结合抗原（Recognition and bind antigen specifically）,识别并特异性结合抗原是免疫球蛋白分子的主要功能，这种特异性主要是由免疫球蛋白V区的空间构型所决定。免疫球蛋白分子有单体、二聚体和五聚体等几种体形式.,抗体在体内与相应抗原特异结合，发挥免疫效应，清除病原微生物或导致免疫病理损伤。例如IgG和IgA可中和外毒素，保护细胞免受毒素作用；病毒的中和抗体可阻止病毒吸附和穿入细胞从而阻止感染相应的靶细胞；分泌型IgA可抑制细菌粘附到宿主细胞。B细胞膜表面的IgM和IgD是B细胞识别抗原受体，能特异性识别抗原分子。抗体在体外与抗原结合引起各种抗原抗体反应。,2、激活补体,补体是动物血清中具有类似酶活性的一组蛋白质，具有潜在的免疫活性，激活后能表现出一系列的免疫生物活性，能够协同其它免疫物质直接杀伤靶细胞和加强细胞的免疫功能。IgM、IgG 与相应抗原结合后，可通过经典途径活化补体。IgA和IgG不能激活补体经典途径，但其凝聚形式可通过旁路途径活化补体，继而由补体系统发挥抗体感染功能。,3、结合细胞：多种细胞表面（如吞噬细胞、K细胞、NK细胞）具有IgFc段（结晶片段）的受体，当Ig通过其Fc与相应受体结合后，可进一步通过受体细胞发挥不同的作用。如增强吞噬作用或杀伤作用。4、通过胎盘：IgG使新生儿自然被动免疫，抵抗感染疾病。,（三）、机体产生抗体的一般规律-初次应答与再次应答,若初次用适量抗原免疫动物时，须经一定的潜伏期(1周以上)才能检出低效价的以IgM为主的抗体，这一现象为初次应答。,此后，在抗体下降时再次注射该抗原进行免疫，则这次潜伏期明显缩短、效价增高，而且维持时间长，此时产生的抗体以IgG为主，这就是再次应答，也称免疫记忆或回忆应答。,有时再次进入机体的是与初次接触抗原不同的另一种抗原，也可引起初次抗原相对应的抗体产生，称非特异性再次应答。,再次应答的抗体类别属免疫球蛋白G（IgG）,机体抗体产生的一般规律,（四）、产生抗体的细胞,抗体的产生是由于巨噬细胞、T细胞、B细胞联合作用的结果。在免疫细胞中，执行固有免疫功能的细胞有吞噬细胞、NK细胞、B1-B细胞等等。执行适应性免疫功能的是T及B淋巴细胞。各种免疫细胞均源于多能造血干细胞（multiple hematopoietic stem cells，HSC）。,抗原与其相应抗体相遇，两者将发生特异性结合。抗原与抗体能够特异性结合是基于两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由抗原与抗体分子的一级结构决定的。在体外，抗原与其相应的抗体结合后，在一定的外界环境条件下，会出现凝集、沉淀、补体结合等反应。由于抗体存在与血清等体液中，所以这类测定法称体液免疫测定法，或称血清学反应检查法。由于反应的特异性，所以可用已知的抗原测定未知的抗体，也可用已知抗体鉴定未知抗原。,三、抗原抗体反应,（一）、抗原抗体反应的一般规律1、特异性 所谓特异性，即一种抗原只能和由它刺激产生的抗体相结合，不能跟与它无关的抗体发生反应。这种特性是由抗原的决定簇基于抗体可变的的化学组成、空间立体构型所决定的。例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素相结合，而不能与破伤风外毒素结合。但由于较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，都可出现交叉反应。,2、按比性 抗原一般都是多价的，而抗体（IgG）则是二价的，只有二者比例适合时，抗原抗体才能结合得最充分，形成的抗原抗体复合物最多，反应最明显，结果出现最快，此称为等价带（zone of equivalence）。如抗原或抗体过多，则二者结合后均不能形成大的复合物，不呈现可见反应，称此为带现象（zone phenomenon），出现在抗体过量时，称为前带（prezone），出现在抗原过剩时，称为后带（postzone）。,3、可逆性 抗原与抗体的结合虽具有稳定性，但由于二者之间是非共价键结合，因此又是可逆的，在一定条件下可解离，且解离后各自生物活性不变。抗原抗体复合物的解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力，二是环境因素对复合物的影响。高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不容易解离。反之，则较易解离。解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结构、活性及特异性。,4、分阶段反应 抗原抗体反应可分为两个阶段：第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两个阶段难以严格区分。,5、敏感性 抗原抗体不仅有高度特异性，还具有较高敏感性，不仅可用于定性，还可用于检测极微量的抗原抗体，其灵敏程度大大超过当前应用的常规化学方法。但反应的类型不同，其敏感性有很大的差异,（二）、影响抗原抗体反应的因素,1、电解质电解质能降低抗原抗体结合物的表面电荷，从而促使其沉淀或凝聚。最常用的是NaCl，适宜浓度为0.15mol/L，即生理盐水在补体结合试验或溶血反应时，在稀释液中加入少量的Cu2+和Mg2+能加强补体的活性。2、pH大多数抗原抗体反应的最适pH为68。当反应pH接近蛋白质的等电点（pH55.5）时，往往导致抗原抗体的非特异性沉淀。pH为23时可使抗原抗体结合物解离。,3、温度反应温度与反应速度有密切关系。温度高时反应速度快，反应的最适温度通常为37。4、振荡机械振荡能加速反应，但强烈振荡可使结合物离解。5、杂质反应中如存在与反应无关的蛋白质、多糖等非特异性的结合物质，往往抑制反应进行甚至引起非特异性反应。,反应的组成成分,1）抗原 2）特异抗体 3）环境因素 基本因素：0.85%NaCl作电解质 反应温度37或56 pH 7.0 特殊因素:补体,反应的基本特点,1）抗原与抗体的结合具有特异性。2）抗原与抗体是分子表面的结合。3）抗原与抗体结合形成可见反应,还与抗原、抗体的相对浓度有关。4）抗原抗体反应分两个阶段：结合阶段：抗原抗体特异结合；反应阶段：结合后受环境因素影 响出现可见反应。,（三）主要的抗原抗体反应,1、凝集反应（Agglutination)2、沉淀反应(Precipitation)3、补体结合试验(Complement fixation test,CFT)4、中和试验(Neutralization test),1、凝集反应（Agglutination),颗粒性抗原与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼可见凝集物的现象，称为凝集反应。,反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。凝集反应又可分为直接凝集反应和间接凝集反应。直接凝集反应是指颗粒性抗原与凝集素直接结合所出现的凝集现象；间接凝集反应是指将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表面，此吸附抗原（或抗体）的颗粒与相应的抗体（或抗原）结合，在有电解质存在的适宜条件下而发生的凝集反应。,2、沉淀反应(Precipitation),可溶性抗原（蛋白质、多糖或类脂溶液、血清、细菌抽提液、组织浸出液等）与其相应的抗体在合适条件下反应并出现絮凝状沉淀物的现象。用于沉淀反应中的抗原称沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称沉淀素（precipitin)。,3、中和反应(Neutralization test),抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应称为中和反应。广义而言，中和激素和酶活性也包括在内。该试验不仅可用于毒素或病毒种型的鉴定与抗原性分析，还可用于抗毒素或中和抗体的效价滴定。这种中和作用，不仅有严格的种、型特异性，而且还表现在量的方面，即一定量的病毒必须有相应数量的中和抗体才能被中和。中和试验的基本过程是，先将抗血清与病毒混合，经适当时间作用，然后接种于宿主系统以检测混合液中的病毒感染力。特异性抗体抑制多种抗原的生物学活性（细菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反应。例如在临床实验诊断中测定风湿病患者体内的抗链球菌 O抗体的反应，都是利用的中和试验。,四、现代免疫标记技术,一、免疫检测方法和技术 免疫标记技术(Immuno-labelling technique)是指将抗原或抗体用荧光素、酶、放射性同位素和电子致密物质等加以标记，借以提高其灵敏度的一类新技术。优点：特异性强、灵敏度高、应用范围广、反应速度快、容易观察、能定位、能定量。,1、免疫荧光技术（Immunofluorescence technique),将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC)和罗丹明（lissamine rhodamine B200,RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。,2、酶免疫测定（Enzyme immunoassay,EIA),用酶标记的抗体来进行的抗原抗体反应。用酶代替荧光素作标记物以及显示酶标记抗体的方法是用酶的特殊底物来处理标本。由于酶的催化作用可使原来无色的底物通过水解、氧化或还原反应而显示颜色。,酶免疫测定的优点,1）反应结果产生颜色，可用显微镜观察结果。2）标本经酶标抗体染色后，还可用其他染料复染，显示细胞形态结构。3）标本可长久保存，随时备查。4）特异性强。5）灵敏度高。,标记酶应具备的特点,1）纯度高、高溶性、特异性强、稳定性高。2）测定方法应简单、敏感、快速。3）与底物作用后会呈现颜色。4）与抗体交联后，仍保持酶活性。最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（horeradish peroxidase,HRP),3、放射免疫测定法(Radioimmunoassaly,RIA),应用同位素标记技术来检测抗原抗体反应的高灵敏度方法。此法兼有放射性同位素标记物所显示的高灵敏度（可达到 ng和pg水平）和血清学反应的高特异性优点。,4、发光免疫测定法(Luminescent immunoassay),将化学发光反应与免疫测定法结合起来的新型技术。常用的发光试剂有鲁米诺（luminol)和光泽精(lucigenin)。,发光免疫测定法优点,1、可定量检测抗原或抗体。2、灵敏度高，约比酶免疫技术高1000倍。3、试剂稳定、无毒。4、检测操作简便、快速（半小时至数小时）。,二、免疫检测技术的应用,免疫检测技术以广泛应用于生物科学的各个领域。1、免疫疾病诊断 2、动物植物生理活动研究 3、物种及微生物鉴定4、动物、植物性状的免疫标记 5、免疫增强药物和疫苗的研究 6、发病机理研究 7、分子生物学研究,1、免疫疾病诊断 用免疫血清学方法对人和动物传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应疾病进行诊断，是免疫技术最突出的应用。尤其是酶标抗体技术，已成为多种传染病的常规诊断方法，如已有的人各型肝炎、猪瘟等 ELISA 试剂盒，它们简便、快速，又具有高度的敏感性和可重复性。,2、动物植物生理活动研究 动植物中存在一些如激素、维生素等活性物质，它们在体内含量极微少，但在调节机体的生理活动中起重要作用，因此通过分析测定这些生物活性物质的含量及变化来研究机体的各种生理功能（如生长生殖等）。由于这些物质含量极低，用常规化验方法难以准确测出。目前放射免疫测定和酶免技术已能精确测出 ng(10-9 g)及 pg(10-12 g)水平的物质，它们已成为测定动物、植物、昆虫中微量激素及其它活性物质，研究动物、植物生理和生物防治的重要手段。,3、物种及微生物鉴定 各种生物之间的差异都可表现在抗原性不同，物种种源越远，抗原性差异越大，因此可用区分抗原性的血清学反应进行物种鉴定、物种的分类等工作。血清学反应在细菌、病原菌等微生物鉴定和血清型及亚型的分析方面已得到广泛应用。但对动物种源，植物和昆虫分类方面还是一个新的领域。,4、动物、植物性状的免疫标记 通过分析动物、植物的一些优良性状（如高产、优质、抗逆性等）的特异性抗原，然后用血清学方法进行标记选择育种，这是一个很有前途的方向，它比分子遗传学标记选择育种简便。,5、免疫增强药物和疫苗的研究 疫苗研究中需用血清学反应和细胞免疫技术测定免疫的效果。在研究一些免疫增强药物，尤其研究肿瘤药物时，需用细胞免疫技术分析测定它们对机体细胞免疫功能的增强作用。因为细胞免疫是机体抗肿瘤、抗病毒的一个重要机制。,6、发病机理研究 传染病的病原从机体特定部位感染，并在特定组织细胞内增殖，引起发病。一荧光抗体感染或免疫酶组化染色，可在细胞水平上确定发病等病原微生物的感染细胞，还可用于研究自身免疫病和变态反应性疾病的发病机理，如免疫复合物的沉积部位的分析。,7、分子生物学研究 在基因工程的分离、克隆的筛选，表达产物的定性与定量分析，表达产物的纯化等均涉及到免疫技术。如通常用免疫沉淀方法分离 mRNA 基因，酶标抗体核酸探针（地高辛核酸探针）检测筛选克隆，免疫转印技术分析表达产物的分子量、ELISA 或 RIA 分析表达量、免疫亲和层析纯化表达产物，免疫方法分析表达产物的性质如免疫原性。免疫技术已是分子生物学研究中必不可少的工具。,