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研究生 医学分子生物学考试重点总结 精华Regulation of gene expression基因的表达调控：不同发育阶段、不同的微环境、不同的功能状态下，选择性、程序性地在特定细胞表达特定数量的特定基因。 Operon操纵子：由功能相关的一组结构基因串联在一起，包括上游的调控区共同构成。 Gene基因：是位于染色体上呈直线排列的遗传单位。从分子水平讲，基因是能表达而形成有功能产物的DNA序列。包括：编码序列；内含子；启动子；调控序列；终止子。 Genome基因组：细胞/非细胞生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。大小由C值表示。人类基因组：22条常染色体，X,Y两条性染色体上全部遗传物质+细胞质中线粒体上遗传物质。基因组的功能-贮存和表达遗传信息。人类基因组有3.2×109bp。 Cellular genome细胞基因组：对于细胞生物而言，一个细胞所有不同染色体上全部基因和基因间的DNA总和称为细胞基因组。 C-Value paradox：生物单倍体基因组所含的DNA总量被称为C值。以基因组的碱基对总数来表示。每种生物各有其特定的C值范围，不同物种的C值相差很大。一般来讲，基因组越大，生物进化程度越高。C值和生物进化程度不一致的现象称为C值悖论。如：人基因组3.2×109bp，肺鱼长达1012bp。 cDNA文库：由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。一个理想的cDNA文库应忠实完整地代表所制备组织中所有的mRNA分子。cDNA文库的主要目的是作为分离和克隆感兴趣的单个重组DNA序列的来源。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。具有易于操作的优点。 基因文库：某生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，在细胞内进行复制转录翻译，经筛选后得到大量的阳性菌落or噬菌体，所有菌落或噬菌体的集合合称基因文库，理想的包含着该物种的全部遗传信息。 Protenome蛋白质组：是蛋白质和基因组两个词的组合词，即基因组表达的全套蛋白质。由于受到基因表达调控的影响，基因表达在同一个体内不同器官间，甚至同一器官的不同阶段，基因表达的情况都会不同，因此蛋白质组是一个动态的概念。 Protemics蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。 比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞与正常细胞间蛋白质在表达数量、表达位置、修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。基本技术平台：双向凝胶电泳技术2-DE；质谱技术MS；生物信息学。 肿瘤蛋白质组学有两种研究方法：比较蛋白质组学；血清蛋白质组学。 功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。技术平台：噬菌体展示技术；酵母双杂交系统；蛋白质芯片技术。 Repetitive sequence重复序列：在基因组中多次反复出现的DNA序列，按其出现频率可分低、中、高度重复序列。出现原因：基因的多拷贝；与染色质的构像,着丝点的形成有关；参与表达调控，染色质DNA的“区间性”。 微卫星(microsatellite)：遍布于人类基因组的短小重复序列，每一重复序列为1bp 6bp，重复次数不超过60次，片段长度小于350 bp。微卫星不稳定性的研究方法：PCR变性PAGE 银染：与正常组织相比较,若某一等位基因条带消失或相对密度减少50 %以上,记为杂合性缺失LOH; 若等位基因条带增多和大小有改变则记为MI。 House-keeping gene管家基因：维持一般细胞正常功能所必需的、而且持续表达的基因，其转录起始区域极少发生甲基化。生殖细胞中，全部组织特异性的基因均不表达且被甲基化。 RNA editing ：RNA编辑：RNA分子上的一种修饰。插入、缺失、核苷酸替换信息改变氨基酸序列不同的多种蛋白质。意义：扩大遗传信息；生物适应。 RNA splicing：RNA剪接：将hnRNA中的内含子序列切除，外显子部分连接起来。组成性剪接：有序地删除mRNA前体中的每一个内含子。选择性剪接(alternative splicing): 某个内含子5的供点可在特定条件下与另一个内含子3受点进行剪接，从而同时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含子。来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，翻译出不同蛋白质，或形成一组相似的蛋白质家族，称为同源蛋白质(isoform)。脊椎动物中约5的基因以该方式剪接，各个同源蛋白质具有相同结构或功能域，还具有特异性质的差别。 表观遗传学：是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰。三个层面调控基因表达：DNA修饰：DNA共价结合1个修饰基团，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态。蛋白质修饰：通过对特殊蛋白的修饰或改变蛋白的构像实现对基因转录的调控。非编码RNA调控：通过某些机制实现实现对基因表达的转录后调控，如RNA干扰。 反义RNA：一段含有与被调控基因所产生mRNA互补碱基序列的小分子RNA。根据其作用机制可分3类：I类反义RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和/或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶III降解；II类反义RNA与mRNA非编码区结合，引起其构象变化，抑制翻译；III类反义RNA直接抑制靶mRNA的转录。 RNAi：RNA干扰：将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，可以使mRNA发生特异性降解，导致其相应的基因沉默，这种转录后基因沉默PTGS称为RNAi。RNA干扰包括起始阶段和效应阶段。RNAi高效性。RNAi目标序列选取原则。 Cell senescence细胞衰老：细胞衰老是正常环境条件下发生的功能减退，逐渐趋向死亡的现象。细胞在形态上发生明显变化，细胞皱缩，质膜透性和脆性提高，线粒体数量减少，染色质固缩、断裂等。 Telomere端粒：由几百个简单无信息的重复序列构成的3端凸出的特出结构。作用：1、保护染色体末端；2、防止染色体复制时末端丢失，导致染色体断端融合；3、固定染色体位置，端粒DNA附着于核基质。 Telomerase端粒酶：一个自带引物的逆转录酶，由RNA和酶蛋白组成。含有1个159nt的RNA部件，该部件含有与端粒d重复序列互补的序列。 端粒、端粒酶与衰老的关系：随着 D N A的复制和细胞的不断分裂，端粒的长度不断缩短，当缩短到影响D N A复制时，染色体失去稳定性，细胞就停止分裂，于是细胞进入衰老死亡阶段。端粒长度决定细胞分裂次数。端粒长度是由端粒酶决定的。正常人体细胞经多次分裂后，端粒缩短，但如果在端粒缩短的同时，激活端粒酶，就能以自身的模板合成端粒，以弥补端粒的缺损，维持染色体的稳定性，使细胞免于衰老死亡而获得生存，发展成为“永生细胞”。 MMR gene 错配修复基因：属于管家基因。可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中未配对的碱基，保证复制和重组的精确性。 Reporter gene报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。在酵母双杂交系统中，BD-X称为诱饵，AD-Y称为猎物，能显示两者相互作用的基因称为报告基因，反过来，可通过检测报告基因来判断猎物与诱饵间有无相互作用。 G蛋白：一般是指与膜受体偶联的异三聚体G蛋白。由三种亚基组成。分子量约100kD。亚基是活性亚基，其上有一GTP结合位点，并具有GTP酶活性，另外还有受体和酶的结合位点。具有特异性，被用作G蛋白分类依据。各种G蛋白亚基都比较相似。G蛋白在结构上没有跨膜蛋白的特点，它们通过对其亚基上氨基酸残基的酯化修饰作用将G蛋白锚定在细胞膜内侧。主要类型：Gs、Gi、Gq、Gt。 s Gs和Gi：效应分子为AC，第二信使为cAMP，靶分子为PKA； s Gq：效应分子为PLC-，第二信使为IP3 DG Ca2+，靶分子为PKC； s Gt：效应分子为cGMP磷酸二酯酶，第二信使为cGMP，靶分子为Na+通道关闭。 SH2 domain：由约100个氨基酸残基组成，介导信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子的结合，这种结合依赖于酪氨酸残基的磷酸化及其周围的氨基酸残基所构成的基序。SH2识别序列的磷酸化酪氨酸位于蛋白质的C端，而PTB结构域识别的酪氨酸位于N端。 SH3 domain：由约50100个氨基酸残基组成，介导信号分子与富含脯氨酸的蛋白分子的结合，其亲和力与脯氨酸残基及其邻近的氨基酸残基所构成的基序序列有关。WW结构域与SH3很相似。 JAK：是胞质内的一类非受体酪氨酸蛋白激酶家族，已发现有4个成员：JAK1，JAK2，JAK3，TYK2。JAK1，JAK2，TYK2广泛存在与各种组织和细胞中，JAK3仅存在于骨髓和淋巴细胞中。其结构不含SH2,SH3结构域，C端具有两个相连的激酶区，N端的几个结构区段无酶活性，可能在受体蛋白与JAK的偶联中发挥作用。 STAT：信号转导子/转录激活子：具有信号传递和转录因子的双重功能。包括STAT1STAT6。STAT的C末端有SH2结构域，而且有一保守的酪氨酸位点，该位点被激活的JAK磷酸化，使STAT活化。 Cyclin box周期蛋白盒：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒，介导周期蛋白与CDK结合。补充：Cyclin也含有降解盒或PEST序列，它可以通过定时降解或恒定地迅速周转来调节这些蛋白质的水平，起着CDK的调节亚基的作用。CDK为催化亚基，cyclin为调节亚基，两者共同组成MPF。 Restriction point：R点：G1/S检验点。在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关事件：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？ MPF促细胞分裂因子：存在于M期细胞中具有促进间期细胞进行分裂的因子。它能激活促使G2/M的转换。由CDK1和cyclinB组成。即MPF = P34cdc2(CDK1)+Cyclin B。 Protain chip蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按照预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。荧光标记是芯片采集中使用最多也是最成功的报告标志。根据固定介质的不同可分为：化学型、生物型。根据片基材料的不同可分为：膜芯片、玻璃芯片、液相芯片等。 Gene chip基因芯片/DNA芯片/DNA微阵列/寡核苷酸阵列：是指采用原位合成或显微打印手段，固相合成数以万计的DNA探针，并把它们有规律地排列在指甲大小的芯片上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，检测杂交信号，从而对生物样品进行快速、高效的检测或医学诊断。通过对正常人的标准图谱和患者的待测图谱的比较分析，可得出病变DNA信息。这种基因芯片技术有快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化的特点。 癌基因：细胞基因组中具有能使正常细胞发生恶性转化的基因，称为癌基因。癌基因是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性，在癌基因异常表达时，其产物可使细胞无限分裂。 激活机制：原癌基因点突变；获得启动子与增强子；扩增；移位或重排。 抑癌基因/抗癌基因/肿瘤易感基因/隐性癌基因：是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。 基因治疗：是指从DNA水平所采取的一切治疗措施和新技术。例如向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷；或采用特定方式关闭、抑制异常表达的基因从而达到治疗的目的。途径：生殖细胞基因治疗；体细胞基因治疗。 基因干预：采用特定方式抑制某个基因表达，或通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。 基因干预的手段：反义RNA；RNAi；三链DNA；核酶裂解特异的靶mRNA。 APUD细胞系统：是指能摄取胺和胺前体并在细胞内脱羧产生肽和/或胺类激素的内分泌细胞的总称。 R-T PCR逆转录PCR：是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术。以由mRNA逆转录而来的DNA为模板，由此产生出来的DNA不带有内含子(基因中不具意义的段落)，常应用于分子克隆技术。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 Express vector表达载体：为了使插入的外源基因能够表达为多肽链而设计的载体称为表达载体。除需载体必备条件外，还需要相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。 基因工程载体分克隆载体、表达载体，前者主要用于克隆和扩增目的基因序列，为研究提供材料及建立基因文库；后者主要用于高效表达目的基因以便获得大量蛋白质产物。 常用的克隆载体： 质粒载体：pBR322-万用质粒，最广泛；pUC18蓝白色菌落筛选。 噬菌体载体：噬菌体衍生物载体；粘粒；单链DNA噬菌体载体。 表达载体根据适应的宿主细胞可分： 原核表达载体：pGEM-3Z；pKK177-3； 真核表达载体：病毒表达载体；酵母细胞的表达载体；昆虫细胞表达载体。 Blotting印迹：将存在于凝胶中的生物大分子转移到固化介质上，并加以检验分析的技术。SouthernDNA；northernRNA； western-蛋白质。 基因重组：是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程。又称DNA重组。包括位点特异性重组、同源重组两种类型。 分子克隆/基因克隆：是按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在受体细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。克隆：无性繁殖系及其后代，基因完全相同。 基因工程/重组DNA技术/基因拼接技术：是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达的操作。 质粒载体plasmid：细菌染色体以外的，能自主复制的双链闭合环状DNA分子。能把外源目的基因送到宿主细胞中克隆扩增或克隆表达。基因工程主要是用人工构建的质粒。总之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的松弛型质粒，且具有一个以上遗传标志和MCS。广泛应用的：pBR32, pUC18等。 MCS多克隆位点：是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。 Taq DNA聚合酶：是一类耐热的DNA聚合酶，有5-3聚合酶活性、5-3外切酶活性。多数Taq聚合酶缺乏3-5外切活性。催化的最适温度范围7075，在95以上高温可半小时不失活。最适合用于PCR。 限制性内切酶：一类由细菌产生的、能专一识别和切割双链DNA中特定碱基序列的核酸内切酶。一般分为I,II,III型，基因工程中常用II型。切割位点：48bp长度，具有回文序列的DNA片段。主要产生3种末端：5-粘性末端；3-粘性末端；平端/钝端。应用：DNA重组、制备探针、分子杂交、序列分析等。 T-A克隆： Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在新链的3末端添加一个核苷酸，通常为A。 T-vector：普通的克隆载体切成线状，并使之在3末端含有一个突出碱基T。Taq酶扩增的产物可以与T载体进行粘端互补链接，达到高效克隆的目的。 CpG Island：结构基因的5端调控区域，CpG常常以成簇串联形式存在，此区域称CpG岛。大小为5001000bp，约56的编码基因含该结构。CpG岛的甲基化阻碍转录因子复合体与DNA的结合，抑制基因转录。 核酸疫苗(nucleic acid vaccine)/ 基因疫苗(genetic vaccine)：是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射or微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。 半保留复制：一种双链脱氧核糖核酸的复制模型，其中亲代双链分离后，每条单链均作为新链合成的模板。因此，复制完成时将有两个子代DNA分子，每个分子的核苷酸序列均与亲代分子相同，这种复制方式称为半保留复制。 转位因子：指能够在1个DNA分子内部或者2个DNA分子之间移动的DNA片段。细菌中则指可在质粒与染色体间或者质粒与质粒间移动的DNA片段。包括：1、插入序列IS；2、转座子Tn；3、可转座的噬菌体。 转座形式：1、直接以DNA形式转座；2、反转录因子转座。 转座机制：1、非复制性转座/简单转座：转座子拷贝数不增加；2、复制性转座：转座子复制，一份留在供体，一份整合在靶位点。反转录因子转座一定是复制性转座。 转位作用的遗传效应：1、基因重组；2、基因突变：插入到基因内部；3、引入新基因；4、染色体畸变。 转基因动物：对动物个体来说，非自身的基因成分属于外源基因，如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中，那么这个外源基因就被称为转基因(transgene)(即转移来的基因)，这种动物就是转基因动物。转基因动物是指将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。 基因家族：核苷酸序列或编码产物具有一定程度同源性，且功能相关的一组基因。同一祖先基因经过重复和突变进化而来。成员可集中在同一染色体某区域，形成基因簇或串联重复基因，也可以分散在不同染色体上，编码一组功能紧密相关的蛋白。 根据同源程度分类：核酸序列相同：单纯多基因家族，如rRNA，tRNA。核酸序列高度同源：人类生长激素基因家族；编码产物具有同源的高度保守的功能区：src癌基因家族。编码产物具有小段保守基序；基因超家族；假基因：多基因家族中那些不产生有功能基因产物的一类基因。用 表示。假基因的核苷酸序列与相应的活性基因极为相似，即同源，这些基因原来也可能是有功能的基因，后来由于缺失、倒位、点突变使其失去活性而形成无功能的基因。它们或者不能转录，或者转录后生成无功能的异常多肽。 根据产物分类：编码RNA的：rRNA，tRNA。编码蛋白质的：组蛋白，珠蛋白，生长激素. Nuelesome核小体：核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone）构成，4种组蛋白H2A、H2B、H3、H4， 每一种组蛋白各2分子形成一个组蛋白八聚体，DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。连接相邻2个核小体的DNA分子上结合组蛋白H1。 DNA损伤 (DNA damage) ：DNA复制过程中发生的DNA核苷酸序列的改变。从分子水平看，指DNA分子碱基顺序或数目的改变。DNA损伤又称基因突变：由于DNA分子中发生碱基对的替换、插入、缺失等,从而引起基因结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。 DNA多态性：在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称DNA多态性。可分为四类：等位基因间DNA位点多态性；RFLP；STR；SNP。 DNA多态性标记：限制性片段长度多态性；单核苷酸多态性。 RFLP限制性片段长度多态性：是指用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一段DNA是否有同样的限制性酶切位点，决定了酶切后是否会产生同样大小的片断。当碱基组成的变化改变了限制酶识别位点时，就会得到不同的限制性片段类型。RFLP的基础是高度重复序列和点突变。通过RFLP来揭示DNA碱基组成不同的技术称为RFLP技术。 串联重复顺序多态性：有一些重复序列的重复单位很小，但串联重复次数有较大的变化，形成串联重复顺序多态性。主要发生在小卫星DNA和微卫星DNA中。这种多态性在人群中有极高的频率。 SNP单核苷酸多态性：是指由单个核苷酸替代、插入、缺失而形成的分子多态性，有时也包括由多个核苷酸插入或缺失造成的点突变。SNP是人类基因组中数量最多的一种多态形式，平均每1000个碱基中就有一个。SNP是一种双等位基因形式的多态，在基因组中某位点要么突变，要么正常。 DNA指纹：针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southren blot 杂交，可以得到大小不等的杂交带，且杂交带数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样，因而把这种杂交带图谱称DNA指纹或基因指纹。 特征：一个DNA指纹探针可同时检测多个位点变异，因而更能反映基因组的特异性；具有高度特异性；具有稳定遗传性；DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发等产生的DNA指纹完全相同。 Ø 乳糖操纵子的结构？作用机制？ 操纵子(operon)：由功能相关的一组结构基因串联在一起，包括上游的调控区共同构成。 乳糖操纵子的结构：含有三个结构基因，编码利用乳糖的三个酶：Lac Z：半乳糖苷酶；Lac Y：半乳糖苷透过酶 ；Lac A：硫代半乳糖苷转乙酰基酶。三个结构基因上游有一个共同的启动子Plac，是RNA聚合酶的结合位点。在启动子的上游有CAP结合位点，下游有操纵序列O，这三者共同构成了乳糖操纵子的调控区，此区域是控制结构基因是否转录的开关。在乳糖操纵子的上游还有一个调节基因I，编码lac阻遏蛋白，在没有诱导剂的情况下，阻遏蛋白可与操纵序列O特异性结合并阻止基因转录。 乳糖操纵子的调控机制： 由阻遏蛋白的负调控和CAP的正调控共同参与。 一、没有诱导剂的情况下：调节基因I编码的lac阻遏蛋白可与操纵序列O特异性结合，阻止RNA聚合酶通过操纵序列达到结构基因，启动子处于关闭或阻遏状态。此时无论周围环境中是否有葡萄糖存在，无论CAP是否活化，RNA聚合酶都无法通过操纵序列，结构基因处于关闭状态。 二、有诱导剂的情况下：乳糖可作为诱导剂，与阻遏蛋白特异结合，使其失去结合操纵序列的能力，从操纵序列上脱落下来，乳糖操纵子的操纵序列开放，RNA聚合酶可以通过操纵序列而进入信息区。即诱导去阻遏。此时：若有葡萄糖存在：细胞内 cAMP浓度很低，cAMP-CAP复合物无法形成，转录仍不能启动。若无葡萄糖存在，则cAMP浓度，cAMP + CAP复合物，结合于CAP结合位点，激活基因转录，促进RNA聚合酶与启动子结合，结构基因得以表达。 CAP：分解代谢物基因激活蛋白，又称为CRP：含DNA结合区、cAMP结合位点。cAMP-CAP导致CAP构像发生变化，可与DNA 分子特定的CAP结合位点结合，激活基因转录。 Ø 真核基因表达调控的特点？ 是一个多水平的复杂过程：1.转录前水平；2.转录水平；3.转录后水平；4.翻译水平；5.翻译后水平 1.转录前水平：基因丢失；基因扩增；基因重排；甲基化修饰。 2.转录水平：涉及三种因素的相互作用RNA polymerase；ACE；反式作用因子。 3.转录后水平：选择性表达何种产物？包括：mRNA前体的加工；剪接；RNA编辑；mRNA通过核孔。 4.翻译水平：可溶性蛋白因子的修饰；5UTR：一个适当长度、无高级结构的、上游AUG密码的5UTR对mRNA有效翻译是必须的。3UTR：polyA尾对翻译的促进与有效结合PABP的长度有关。 对mRNA稳定性的调节：催乳素乳腺组织中酪蛋白mRNA半衰期提高20倍。红细胞分化过程中，细胞专一性降解其他mRNA，而保留珠蛋白mRNA。反义RNA对翻译的调节。 5.翻译后水平：前体的剪切、磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰。 特点： 1、 真核基因组DNA与蛋白质形成较为紧密的染色体结构分布于细胞核内，这种结构使得真核基因较难进入转录状态，基因转录的启动除了RNA 聚合酶、相应的DNA元件外，还需要更多的蛋白质因子参与。 2、 转录和翻译在细胞内不同部位，独立又相互联系。因此真核基因表达调控可在转录和翻译各层次进行。 3、 真核基因大多为断裂基因，转录产物必须进行加工和修饰才能参加蛋白质的生物合成，因此可通过对RNA加工的调节来调控基因表达。 4、 真核生物mRNA经过加工成熟后由核内进入胞质，有帽子和polyA尾结构，寿命较原核生物大大提高，这为翻译水平的调控提供了较大空间。 5、 真核生物的RNA 聚合酶对启动子的亲和力很小，因此转录的起始需要依赖一些激活蛋白的作用，真核基因的转录主要以正性调节为主。 6、 真核基因表达调控除了少数受到外界环境影响外，主要还受到生物体内的一些调控信号的影响，如激素和细胞因子等。 Ø 真核基因组特点？ 1. DNA量大：基因组DNA为双链线状，与蛋白质结合形成多条染色体，储存于细胞核内。染色体由一连串核小体组成。 基因组庞大，结构复杂，具有多个复制起点。 2. 断裂基因：不连续，外显子(exon)：为蛋白质氨基酸编码的DNA序列。内含子(intron)：插入到编码序列之间的非编码序列。真核生物细胞平均每个基因含8个内含子。功能：含调控序列，参与基因表达。不同剪接产生不同产物。 3. 存在大量重复序列(repeated sequence)：在基因组中多次反复出现的DNA序列。按其出现频率可分： 低、中(103-104) 、高(106)度重复序列。出现原因：基因的多拷贝；与染色质构像，着丝点形成有关； 参与表达调控，染色质DNA的“区间性”。 4. 不存在操纵子结构。功能相关的基因构成各种基因家族。可串联在一起，亦可相距很远，即使串连在一起也是分别转录。 5. 非编码序列90%以上，远远多于编码序列。 6mRNA为单顺反子，一个RNA一种蛋白质。 7. 也存在可移动的DNA成分：无明显生物学功能自私DNA 8. 真核基因组 = 核基因组 + 细胞器基因组 Ø 原核基因组特点？ 1、 基因组DNA为一环状双链分子，位于细胞中央，无核膜，称为类核。 2、 只有一个复制起点。 3、 编码序列约50%。 4、 基因连续，无内含子。 5、 无基因重叠现象 6、 具有操纵子结构：数个功能相关的结构基因串连在一起，连同上游的共同调控区和下游的转录终止信号构成的基因表达单位。基因转录的mRNA为多顺反子，分别翻译各自的蛋白质。 7、 重复序列很少，结构基因多为单拷贝。 8、 细菌基因组存在可移动的DNA序列转位因子 9、 细菌基因组=染色体DNA+质粒DNA Ø 真核生物基因转录前表达调控的方式？ 发生在基因组水平上的基因结构的改变。包括：基因丢失、基因扩增、基因重排、甲基化修饰。 1. 基因丢失：体细胞分化过程中，必须将某些基因永久性关闭。最简单有效方式-将这些基因丢失。将要分化为生殖细胞的细胞则一直保留着整套基因组。 2. 基因扩增：发育分化、环境条件的改变，对某些基因产物需要量急剧增加-增加该基因拷贝数。多数人认为是基因反复复制的结果。不适当的基因扩增，可导致肿瘤的发生。基因组扩增：肝细胞的基因组是通过多倍体扩增的。成人肝细胞4倍体占60。这些多倍体细胞的代谢极其活跃。多倍体可能有益于连续产生大量的蛋白质和酶。 3. 基因重排：某些基因片段改变，原来存在的顺序重新排列组合。 4. 甲基化修饰：脊椎动物中，DNA上特定的CpG序列处，C可发生甲基化修饰。mCpG约占CpG的70%。DNA甲基化对转录的抑制主要决定于两个因素：甲基化CpG的密度、启动子强度。转录活跃的基因是低甲基化或不甲基化，而不表达基因则高度甲基化。如：珠蛋白基因：红系细胞-低甲基化；不表达珠蛋白细胞-高甲基化；生殖细胞中，全部组织特异性的基因均不表达，且被甲基化。甲基化修饰与肿瘤发生有密切关系。 5. 染色质结构：DNA + HP+ NHP+ RNA = Chromosome HP：含碱性氨基酸25%；与DNA很高亲和力；细胞内大量存在；进化上较保守；与核小体的稳定和高级结构的组装有关，保护DNA免受损伤，维持基因组的稳定性，抑制基因表达。 NHP：多为中性or酸性蛋白；种类多，数量少，分子量比HP大，激素-受体复合体结合位点，有种属特异性和组织特异性，且处于不同细胞周期和不同分化阶段的NHP也有差异。 Ø 顺式调控元件CAE？ 概念：与结构基因串联的特定的DNA序列，可以与特异转录因子结合而影响转录。 启动子(promoter)：与RNA聚合酶结合并起动转录的DNA序列。真核生物启动子分、 3类，分别结合3种不同的RNA pol，也需3种不同的转录因子，即TF、TF和 TF。 启动子包括：核心启动子、上游启动子元件。 1.核心启动子：足以使RNA pol转录正常起始所必需的、最少的起始子。 TATA盒：核心序列TATAATAAT，位于转录起始位点 -25 bp -35bp区域。 作用：决定了转录的精确起始；介导转录起始复合物的形成；产生基础水平的转录。 2.上游启动子元件(upstream promoter element, UPE)：主要有CAAT盒、GC盒。 CAAT盒：核心序列为GCCAAT，位于转录起始位点- 75bp区域，与转录起始的频率有关。 GC盒：核心序列为GGGCGC，位于转录起始位点- 40bp -110bp区域。与SP1结合并激活转录。 增强子(enhancer)：增强启动子功能，促进基因转录活性。必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。Sv40 DNA是最先被发现的增强子，约200bp。增强子的特点：有组织特异性；无基因特异性；无方向性；远距离作用(3000bp)；有相位性。 沉默子(silencer)：抑制基因转录。同一DNA序列即有增强子的活性，又有沉默子的活性，决定于与其相互作用的蛋白质因子。 加尾信号：在polyA尾位点上游1020bp处，常见一保守的AATAA序列，如果除去此序列，基因将会连续转录下去而不终止。 Ø 反式作用因子(trans-acting factor) / DNA结合蛋白的结构、作用机制？ 概念：由位于不同染色体或同一染色体上相距较远的基因编码的蛋白质因子。由于其结构上含与DNA结合结构域，能与特定DNA序列结合，因此也称DBP。CAE是其结合位点。 结构域：蛋白质分子的构像上相互独立的区域，与分子的功能和特性有关。 基序(motif)：具有功能意义的亚结构域。 结构：一个完整反式作用因子含2个必不可少的结构域： 一、DNA结合结构域(DNA-BD) -与DNA特定序列结合。 锌指结构域(zinc finger motif)：最普遍，最常见。有C2H2, C4。 同源盒结构域(homeodomain, HD)：具有HTH结构； 亮氨酸拉链(leucine zipper)：高度保守。两性螺旋-形成螺旋时，L分布于螺旋同一侧面，形成疏水面；另一侧由亲水基团形成亲水面。此结构称为两性螺旋。通过该结构域，可形成同源or异源二聚体，二个分子螺旋的亮氨酸一侧是形成二聚体的基础，形同拉链。二聚体另一端的碱性结构域，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。2个碱性结构域呈对称排列，与DNA分子相应的识别位点以相反的方向结合，并像夹子样夹住DNA。 螺旋-袢-螺旋 (Helix-Loop-Helix, HLH)：与亮氨酸拉链结构相似。碱性区域为结合DNA所必需。 二、转录活化结构域(AD) -发挥转录活化功能。 酸性-螺旋结构域；富含谷氨酰胺结构域；含脯氨酸结构域。 反式作用因子家族： 类固醇受体家族：结合激素、结合DNA、结合细胞内阻扼蛋白。 AP1家族： c-Fos、c-Jun、亮氨酸拉链、第三信使。 STAT家族：一组胞质蛋白，经过磷酸化和多聚化修饰，就可进入细胞核内，直接与靶基因的调控元件结合，并活化靶基因。将配体在细胞表面的结合与细胞核内基因表达的活化两种功能直接耦联。 反式作用因子的作用机制： 转录因子相互作用； 竞争性排除组蛋白：序列特异性转录因子与转录起始复合物稳定结合，可竞争性地排除组蛋白，阻断其对转录的抑制作用。 与核基质蛋白作用：某些转录因子的活化区域与核基质结合，将基因锚定于那些具有其他转录因子及随后过程所必需因子的区域，促进基因转录。 DNA解旋作用：某些转录因子(TFH)具有DNA解旋酶的作用，在转录起始点使DNA双螺旋解旋。 Ø 比较蛋白质组学的技术平台？ 比较蛋白质组学：通过比较分析不同条件蛋白质组的差异表达，着眼发现和鉴定出有差异的蛋白质或蛋白质群，即比较蛋白质组学。可通过比较同一个体肿瘤细胞与正常细胞之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或着发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。技术平台：1、双向凝胶电泳技术2、质谱技术3、生物信息学。 1、双向凝胶电泳two-dimensional gel electrophoresis,2-DE 原理：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，先经第一向电泳-等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)，再经第二项电泳-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离。为首选的蛋白质分离技术。 补充：蛋白质分离的其他方法：液相色谱(LC)；毛细管电泳(CE)；激光捕获显微切割技术(LCM)。 2、质谱技术mass spectrometry, MS 20世纪XX年代后期，基质辅助激光解吸电离和电喷雾电离两种“软电离” 技术的出现使得质谱技术得到迅速的发展，成为蛋白质鉴定的核心技术。所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。-2-DE与MS的联合应用成为蛋白质组学研究的基本技术平台。 3、生物信息学biological informatics 是生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科。通过对生物大分子信息的获得、加工、存储、分类、检索与分析，以达到理解这些生物大分子信息的生物学意义。可用于寻找蛋白质家族保守序列和对蛋白质高级结构进行预测。 在蛋白质组学研究中有两个重要应用：一是分析和构建双向凝胶电泳图谱，二是搜索与构建蛋白质组数据库。生物信息学的组成：数据库、工具软件 。 表达蛋白质组学新发展-定量蛋白质组学：差异凝胶电泳(DIGE)；同位素标记相对和绝对定量。 Ø 比较蛋白质组学的基本实验流程？ 蛋白样品的制备及定量；总蛋白的双向凝胶电泳；凝胶分析软件分析； 胶内酶解； 质谱分析； 数据库搜索鉴定蛋白性质。 双向电泳蛋白样品制备的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）尽量破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用， 使蛋白质处于完全变性状态。 Ø 功能蛋白质组学的几种研究方法及基本原理？ 功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与 DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容