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生物选修三易考知识点背诵生物选修三易考知识点背诵 专题1 基因工程 基因工程的概念 按照人们的愿望，进行严格的设计， 通过体外DNA重组和转基因技术， 赋予生物以新的遗传特性，创造 出更符合人们需要的新的生物类 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 特点 本质 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切 拼接导入 表达 产生人类需要的基因产物 打破种的界限，定向改造生物 基因重组 型和生物产品。基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的， 又叫做DNA重组技术。 1.1基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。300多种微生物分离出4000多种限制酶 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 限制性内切酶与DNA解旋酶的区别 限制酶 DNA解旋酶 将DNA两条链的氢键打开形成两条单链 、限制酶的识别序列： 能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 区别 割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键 1 要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？两个四个 思考：、限制酶存在于原核生物中的作用是什么？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵 2.“分子缝合针”DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶的比较： 相同点：都缝合磷酸二酯键。 区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4-DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同： DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”载体 载体具备的条件： 2 携带外源DNA片段的载体能在受体细胞中复制并稳定保存。或者整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制 具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。 思考： 作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？ 霍乱菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？ 目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 标记基因是否表达 真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。 补充：真核生物与原核生物基因结构的 编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质 非编码区：不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质 有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。 启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。 RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.催化DNA转录成mRNA 原核细胞基因的编码区是连续的、不间隔的，真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的. 知识点一：1.原核细胞的基因结构非编码区编码区上游启动子编码区非编码区编码区下游终止子与RNA聚合酶结合位点启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)3 知识点一：2.真核细胞的基因结构非编码区编码区非编码区编码区上游启动子与RNA聚合酶结合位点编码区下游终止子外显子内含子 真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。 不同点 相同点 内含子：不能够编码蛋白质的序列叫做内原核细胞 真核细胞 含子外显子：能够编码蛋白质的序列叫做外显子编码区是 的 编码区是间隔的、 的 都由能够编码蛋白质的_ 和具有调控作用的 区组成的 1.2.基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：是人们所需要转移或改造的基因 2.获取目的基因的方法基因文库 、人工合成、 PCR技术 3.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 4、PCR技术 概念：PCR全称为多聚酶链式反应迅速扩增DNA片段，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 原理： 条件： 4 方式：以 方式扩增，即 PCR技术与体内DNA复制的区别： a. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； b. PCR需要耐热的DNA聚合酶，生物体内的聚合酶在高温时会变性； c. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。 a.变性(9095):DNA模板解链 b.退火(5560):引物与模板结合，形成局部双链 c.延伸(7075):TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链 c.重复循环： 直接分离基因5.如何从基因文库中得某生物体内全部DNA 到所需要的基因？ 依据： 目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列 、基因的功能、 基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因翻译产物蛋白质等特性 限制酶许多DNA片段与运载体连接导入受体菌群体基因组文库5 某种生物某个时期的mRNA反转录cDNA与运载体连接导入受体菌群体cDNA文库第二步：基因表达载体的构建 基因工程的核心 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因启动子终止子标记基因+复制原点 启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 6 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： (1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 (2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 (3)将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。即用DNA探针 2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。方法是采用分子杂交技术。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。 4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。需要做抗虫或抗病的接种实验，如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 7 1.3基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质和利用植物生产药物等方面抗虫基因Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 引起生物生病的微生物，主要有病毒、真菌和细菌等 抗病转基因植物所采用的基因：病毒外壳蛋白基因,病毒的复制酶基因 抗真菌的基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因、其他抗逆转基因植物 2.动物基因工程： 提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物，用转基因的动物作器官移植的供体 利用基因工程对猪的器官进行改造方法：将器官供体基因组导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官 基因工程药品异军突起 利用基因工程方法制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。 工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系 传统疫苗存在许多缺点：生产过程需大量繁殖病原体，对工作人员健康造成很大威胁；病原体的减毒、灭活有可能不够彻底，导致接种者直接感染。 基因工程疫苗：将起关键作用的、序列保守的蛋白质基因重组到细菌或真核细胞内，生产蛋白质，制作成疫苗。它不使用病原体本身，所以安全，还可以把不同病原体的抗原基因重组到同一受体细胞，生产多价疫苗 8 基因治疗曙光初照 基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。 探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子； 原 理：利用DNA分子杂交原理； 基因探针：基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。 基因治疗概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效的手段。 实例： 对严重复合型免疫缺陷症的治疗，将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，再将这种淋巴细胞转入患者体内 基因治疗的类型 体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。 体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移的治病方法。 9 1.4蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质 蛋白质工程的基本原理：它根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。 基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。 设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列 蛋白质的改造 大改：设计并制造自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能 10 中改：在蛋白质分子中替代某一个肽段或一个特定的结构域 小改：通过基因工程中的定点诱变技术，有目的改造蛋白质分子中某活性部位的1个或几个氨基酸残基，以改善蛋白质的性质和功能 定点诱变技术是改变蛋白质结构的核心之一，PCR技术是基因定点诱变的常用方法 蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白质工程 基因工程 实质 通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，将目的基因从供体转移到受体细胞，甚至创造自然界不存在的蛋白质 结果 联系 合成自然界不存在的蛋白质 并在受体细胞中表达 只能生产自然界已存在的蛋白质 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程 专题2 细胞工程 概念：应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。 细胞工程与基因工程：前者是细胞水平或细胞器水平上生物技术,后者是分子水平上的生物技术 2.1.1植物细胞工程的基本技术 一、植物组织培养技术 1、原理：植物的细胞全能性 细胞具有全能性的原因：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞 2、过程：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织胚状体试管苗植物体 愈伤组织的特点：一团没有特定结构和功能不处于旺盛分裂状态的薄壁细胞，高度液泡化， 无定形状态，排列疏松无规则的组织 脱分化：已经分化的植物细胞形成愈伤组织的过程 再分化：愈伤组织生长一段时间后，再移植到新的培养基上继续培养，重新诱导分化形成根和芽切取形成层移栽无菌接种脱分化诱导愈伤组织的形成培养室再分化试管苗的形成11 等器官的过程。 3、用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。 分化程度低幼芽或幼根？去分化较易无机物、有机物遮光脱分化条件？和植物激素 、为什么诱导愈伤组织的 过程中应避光培养？ 有光时，往往容易形成维管 组织，不易形成愈伤组织。 (2)在组织培养实验中，为什 么要强调所用器械的灭菌 一、植物组织培养的过程无定形状态特点？愈伤组织薄壁细胞高度液泡化植物激素：光照再分化细胞分裂素、生长素排列疏松、无规则无叶绿体,不进行光合根、芽繁殖速度快作用不受季节限制工厂化生产优点？幼苗无毒植物体保持优良性状理论基础：细胞的全能性和实验人员的无菌操作？ 防止杂菌污染，因为杂菌生 长快，会和培养物争夺营养。杂菌生长过程中会产生有害的物质，导致培养物迅速死亡。 (3)在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分，是否也能培养成小植株，你能用实验的方法进行验证吗？ 胡萝卜的其他部分也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。 植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 脱分化的实质和结果分别是什么？实质是恢复细胞的全能性过程。结果是形成愈伤组织 思考：番茄马铃薯利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？ 12 二、植物体细胞杂交技术1、过程植物细胞的融合植物细胞A去壁植物体细胞杂交过程示意图植物细胞去壁原生质体植物组织培养方法？融合完成的标志原生质体A原生质体B去壁人工诱导融合的原生质体AB杂种细胞脱再AB分生出细胞壁化愈伤组织再分化杂种植株原生质体融合再生细胞壁等量去壁纤维素酶果胶酶杂种细去胞分化愈伤组织再分化杂种植株离心、筛振动、激素电刺激、选聚乙二醇激素植物细胞B促进融合的方法？因为不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的。 2、植物诱导融合的方法：物理法离心、振动、电刺激等。化学法一般用聚乙二醇作为诱导剂。 注意：a生理基础：细胞膜流动性，植物细胞全能性 b植物细胞融合前需用酶解法除去细胞壁 3、意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 思考：“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？ 主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，所以杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯。 2.1.2植物细胞工程的实际应用 植物繁殖 1、微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖 原理：植物细胞的全能性 13 优点：繁殖率高，可大批量生产； 取材少、培养周期短； 保持优良性状。 2、作物脱毒：采用茎尖植物分生区组织培养来除去病毒 3、人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输 人工种子结构：人工薄膜+胚状体 优点：不受气候、季节、地域的限制；保留优良性状；时间短，占地少 技术：组织培养 原理：细胞全能性 人工种皮中有效成分：养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌 生长调节剂 作物新品种培育 1、单倍体育种： a过程：植株通过减数分裂得到花粉；对花粉进行花药离体培养；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株。 b 优点：明显缩短育种年限，后代稳定遗传 突变体利用：诱导突变体利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出对人类有用的突变体 植物细胞培养： 通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，让它们能够产生大量的次级代谢产物。 注意：1、原理：细胞增殖 2、大规模获得细胞产品应用组织培养技术培养到愈伤组织阶段 14 细胞产物的工厂化生产：紫草素、人参皂甘、红豆杉与紫杉醇 2.2动物细胞工程 一般包括动物细胞培养、细胞核移植、细胞融合、单克隆抗体的制备等技术 2.21动物细胞培养和核移植技术 、动物细胞培养 概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 原理：细胞增殖，要求培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附 动物细胞培养的流程：取动物组织块剪碎用胰蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。只有一层细胞； 动物细胞培养需要满足以下条件 无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 营养：合成培养基成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。 温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5+0.5； pH：7.27.4。 气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 动物组织块幼龄动物的器官组织；动物胚胎动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培胰蛋白酶处理分散成单个细胞加入培养液细胞贴壁细胞悬液接触抑制适宜条件原代培养用胰蛋白酶等处理贴壁细胞传代培养原代培养传代培养不死性细胞养医学研究的各种细胞。 1生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、 单克隆抗体等 15 2健康细胞培养：如获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。 3用于检测有毒物质 4用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据 思考：1、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？ 主要是蛋白质(胶原蛋白等) 2、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织分散成单个细胞时要注意什么问题呢？ 能，应注意时间的控制 3、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶没有活性， 而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。 植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的植物组织培养细胞的全能性固体培养基蔗糖植物激素动物细胞培养细胞增殖液体培养基葡萄糖动物血清细胞株、细胞系植物体快速繁殖、培育无获得细胞或细胞分泌蛋白病毒植株动物体细胞核移植技术和克隆动物 概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。 1、哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。 2、受体细胞：M期的卵母细胞选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。卵母细胞质具有调控细胞核发育的作用或有启动核基因表达的物质 3、体细胞核移植的大致过程是： 思考：在体细胞的细胞核移植到受体 卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵 母细胞的核？ 3、过程供体细胞核移植体细胞注入无核卵母细胞代孕母体杂种细胞细胞培养卵母细胞杂种细胞16 细胞融合去核构建重组胚胎胚胎移植新个体(与母体基本相同的个体)胚胎移植为使核移植动物的主要遗传物质全部来 自有利用价值的动物提供的细胞 用于核移植的供体细胞一般都选用 传代10代以内的细胞，想一想，这是 为什么？ 10代以内的细胞一般保持正常二倍体 的核型，未发生突变 .你认为用上述体细胞核移植方法 生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，还与所处环境有很大关系. 思考(1)对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？ 卵母细胞采集、培养M期卵母细胞去核去核卵母细胞体细胞核移植过程供体细胞注入去核卵母细胞体细胞培养胚胎电激处理使供体核进入受体移植代孕母牛克隆牛卵母细胞构建重组胚胎4、多莉羊的培育过程母绵羊卵细胞母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核移植细胞核融合后的卵细胞卵裂早期胚胎胚胎移植C母绵羊子宫妊娠分娩多莉羊供体牛多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。 讨论分析上述哪一种措施更科学？并说明理由？ 17 卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功 将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便高产奶牛的克隆过程更科 如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？ 首先从卢辛达耳朵上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。 5、体细胞核移植技术的应用： 加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； 保护濒危物种，增大存活数量； 6、追踪研生产珍贵的医用蛋白； 作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。究疾病的发展过程和治疗疾病 6、体细胞核移植技术存在的问题： 、成功率低 、存在健康问题 、克隆动物食品的安全性也存在争议 、克隆动物的各个环节也有待改进 练习：1回答下列有关动物细胞培养的问题： 在动物细胞培养过程中。当贴壁细胞分裂生长到细胞表面 时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的 。此时，瓶壁上形成的细胞层数是 。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是 。 18 随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现 现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成 细胞，该种细胞的黏着性 ，细胞膜表面蛋白质的量 。 (3)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到 期的细胞用显微镜进行观察。 (4)在细胞培养过程中，通常在 条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中 的活性降低，细胞 的速率降低。 (5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作 进行攻击。 2、继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答： 将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是 。 在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的 细胞中特异表达。 为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的 转入 细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为 。该重组细胞发育的过程中还应用了 技术。 2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体 1.细胞融合：是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。 自然发生：受精卵 人工诱导：利用诱导剂诱导动物细胞融合 诱导因素：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒或电激等。 什么是病毒的灭活？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。 19 灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜 上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 2、动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 3、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较： 细胞工程 理论基础 融合前处理 诱导手段 植物体细胞杂交 细胞的全能性、细胞膜的流动性 动物细胞融合 细胞增殖、细胞膜的流动性 酶解法去除细胞壁 注射特定抗原，免疫处理正常小鼠 物理法:离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 物理法:离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 生物法：灭活的病毒 诱导过程 第一步：原生质体的制备 第二步：原生质体融合 第三步：杂种细胞的筛选和培养 第四步：杂种植株的诱导与鉴定 正常小鼠免疫处理动物细胞的融合杂交瘤细胞的筛选与培养专一抗体检验阳性细胞培养单克隆抗体的提纯 用途和意义 克服远缘杂交的不亲和障碍， 应用：白菜-甘蓝等杂种植株 备单克隆抗体治疗、预防疾病，例如“生物弹”治疗癌症 断 4.单克隆抗体 a.抗体：一个效应B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。 b.B淋巴细胞特点：可以产生抗体，但不能无限增殖； 骨髓瘤细胞特点：能无限增殖，但不能产生抗体。 20 抗原注入小鼠体分B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 单克隆抗体的制备过程：(如左图) 细胞两两融合后，有哪些类型？ B-B 瘤-瘤 B-瘤(杂交瘤细胞) 细胞融 如何筛选出杂交瘤细胞？ 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 小资料 细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能杂交瘤细胞 细胞选择培养细胞 注入体内培养 从腹水培养体外培养 从培养液单克隆抗体 被氨基嘌呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？ 在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，仅有 D 合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞因为可以利用淋巴细胞中的 S 途径合成DNA而增殖。 再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养，使每孔细胞不超过一个，再由这些单细胞克隆生长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。 21 注射抗原免疫经过免疫的B淋巴细胞诱导细胞融合动物细胞融合技术动物细胞培养技术骨髓瘤细胞杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的特异性抗体。 单克隆抗体的制备过程：杂交细胞筛选杂交瘤细胞筛选特异性杂交瘤细胞体外或体内细胞培养杂交瘤细胞系提取单克隆抗体特点：既能产生专一抗体又能大量繁殖单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。 特点：特异性强灵敏度高可大量制备单克隆抗体的作用： 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。 专题3 胚胎工程 胚胎工程指对动物早期胚胎或 配子 所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需要移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求 1.操作对象：早期胚胎和配子 2.技术手段：胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等 3.理论基础：哺乳动物的受精卵和早期胚胎的发育规律 3.1 体内受精和早期胚胎发育 生殖细胞的发生和受精作用 1.精子与卵细胞的发生过程 精子的发生：精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂；变形过程中，细胞核为精子头的主要部分，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，22 其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。线粒体为精子运动提供能量 第阶段：精子细胞变形成精子高尔基体发育中的顶体第阶段初级精母细胞的形成有丝分裂多个精原染色体复制精原细胞细胞多个初级精母细胞线粒体A、顶体的发生第2 阶段精子细胞的生成初级精母细胞M次级精母细胞减数分裂M发育中的尾(中心体)B、尾的发育C、精子头的出现顶体线粒体鞘原生质滴E、精子的形成尾D、细胞质浓缩精子细胞精子细胞变成精子的过程中,细胞中很多结构会消失,而细胞核却保留了下来,对这一现象怎样理解?为什么精子中的线粒体集中在尾的基部? 细胞核是精子遗传物质储存和复制的场所，也是参与精、卵结合和后代遗传特性与细胞代谢活动的控制中心。线粒体则是精子进行有氧呼吸分解营养物质产生运动能量的场所。精子的线粒体集中在精子的尾部，是精子维持生存和运动能量的“动力工厂”或“发动机”。 卵子的发生： 第一阶段: 胚胎期间性别分化后开始到胎儿出生前完成,卵巢内卵原细胞就通过有丝分裂形 成初级卵母细胞,被卵泡细胞包围,形成卵泡. 第二阶段: 初情期后初级卵母细胞减数分裂，卵泡发育成熟并排卵。 卵泡期-排卵期-黄体期 卵子是初级卵母细胞或次级卵母细胞 第三阶段: 受精作用过程中 减数第二次分裂是在 精子和 卵子结合的过程中完成的。成熟的卵细胞外层依次由 放射冠 、透明带、卵黄膜等三层结构组成。在卵黄膜和透明带的间隙可以看到二个极体时，标志完成了受精作用 23 说明：马排出的是初级卵母细卵原细胞一、胚胎时期，卵原细胞经胎有丝分裂，增加数量，并演变儿初级卵期母细胞成初级卵母细胞，。二、青春期后，初级卵母初级卵母细胞细胞分批发育，在排卵前后完成第一次成熟分裂，生成一个初情次级卵母体积较大的次级卵母细胞。细胞第一三、在受精时精子穿入的期极体激发下，次级卵母细胞完成第后合子二次成熟分裂，形成一个成熟二个极体的卵子。胞；绵羊、牛、猪排出的是次级卵2N母细胞和第一极体