消化道寄生虫的病原检查.docx

消化道寄生虫的病原检查消化道寄生虫的病原检查 对消化道寄生虫感染或寄生虫病的病原检查，主要是根据寄生虫排离阶段可随粪便排出体外，如蠕虫的虫卵、幼虫、成虫或节片，原虫的滋养体、包囊、卵囊或孢子囊，以及某些节肢动物；有些虫体如雌性蛲虫可在肛周产卵，牛带绦虫孕节片主动从肛门逸出过程中被挤破、虫卵可散落在肛周，因而可从肛周检获虫卵或虫体。所以，采用粪便检查或肛门周围检查寄生虫是对消化道寄生虫检查的主要手段。要取得粪便检查的准确结果，必须注意： 保证粪便新鲜，送检时间一般不超过24小时，尤其对原虫滋养体检查，必须在粪便排出后半小时内进行，或暂时保存在3537 条件下待查； 盛粪便的容器须干燥、洁净，无尿液或水混入，以及无药物、泥土和杂质污染； 容器外贴有标签，注明受检者姓名和受检目的等； 受检粪量一般为510g ，若要求作粪便自然沉淀或血吸虫毛蚴孵化， 受检粪量一般不少于30g，检查蠕虫成虫或绦虫节片则留检一日内全部粪量； 要严格按照粪检程序进行操作，特别是镜检时要熟悉各病原体形态特点并遵顺序观察的原则，以免漏检。人体常见寄生虫的形态特征及鉴别见下表。 人体常见寄生虫卵的鉴别 蠕虫卵与异物的区别 粪便直接涂片法检查消化道寄生虫 适用于检查蠕虫卵、原虫的包囊和滋养体。方法虽简便，由于取材较少，故检出率较低，若连续涂片3 张，可提高检出率。 1检查蠕虫卵 在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水，用竹签或牙签挑取米粒大小的粪便，置于生理盐水中均匀涂抹。其厚度以载玻片置于报纸上，能透过粪膜隐约辨认玻片下的字迹为宜。一般在低倍镜下检查，如发现可疑虫卵转用高倍镜观察时，需加盖玻片，以免污染镜头。镜检时光线要适当，过强的亮度会影响观察效果。应注意虫卵与粪便中的异物区别，可依据虫卵的形状、大小、颜色、卵壳 和内含物等特征加以鉴别。由于雌性蛔虫产卵量较大，该法特别适用于检查蛔虫卵，涂片1张的检出率约为85，涂片3张的检出率可达9095。 2检查原虫 可根据原虫不同的排离阶段，采用不同的方法。 活滋养体检查：方法同检查蠕虫卵，但涂片要薄而均匀。要求粪便新鲜，不能混入尿液和水。若为检查溶组织内阿米巴，对其粘液血便标本，要取粘液部分。在气温较低时，要注意保温，必要时可用保温台保持温度，或先将载玻片和生理盐水略加温，为使滋养体保持活动状态，便于观察。 包囊碘液染色检查：以碘液代替生理盐水滴加于载玻片上，挑取米粒大小的粪便置于碘液中，调匀涂片，加盖玻片。若需同时检查滋养体，可在玻片的另一侧滴一滴生理盐水，同上法涂抹粪便标本，再加盖玻片。这样可使一侧查活滋养体，而加碘液的另一侧查包囊。染色后的包囊呈黄色或棕黄色，糖原泡为棕红色，囊壁、核仁和拟染色体均不着色。 碘液配方：碘化钾4g ，溶于100 ml 蒸馏水中，再加入碘2g ，溶解后贮于棕色瓶中即可使用 厚涂片透明法检查消化道寄生虫 该法即改良加藤法，适用于检查蠕虫卵。用大小约4cm×4cm的100目英寸的尼龙网覆盖在粪便标本上，用塑料刮片在网上刮取粪便约50mg，置于载玻片上，用浸透甘油孔雀绿溶液的玻璃纸片覆于粪便上，以胶塞轻压使粪便展开约20mm×25mm大小模块。置于3036温箱中约30分钟，或25约1 小时，待粪膜稍干并透明即可镜检。 本法要注意掌握粪膜的合适厚度和透明时间，若粪膜过厚，透明时间短，虫卵难以发现；若透明时间过长，虫卵则变形，也不易辨认。如检查钩虫卵时，透明时间一般不要超过30 分钟。 玻璃纸制备：将玻璃纸剪成大小约22 mm×30 mm 的小片，浸于甘油孔雀绿溶液中，浸泡24小时以上，直至玻璃纸呈现绿色 定量透明法检查粪便虫卵及计数 定量透明法适用于各种粪便内蠕虫卵的检查及计数，可测定人体内蠕虫的感染度，也可判断药物驱虫效果。此法系在厚涂片透明法的基础上，定量刮取粪便，并检出粪内全部虫卵予以计数。应用改良聚苯乙烯作定量板，大小为40 mm×30 mm×137 mm，模孔为一长圆孔，孔径为8 mm×4 mm，两端呈半圆形，孔内平均可容纳粪样417 mg。操作时将定量板置于载玻片上，用手指压住定量板的两端，自筛网上刮取的粪便填满模孔，刮去多余的粪便。掀起定量板， 载玻片上留下一长条形的粪样。将浸透甘油孔雀绿溶液的玻璃纸 覆盖在粪样上，用胶塞轻轻加压，使粪样展平铺成一长椭圆形， 在25 经1 小时后即可镜检，顺序观察并记录粪样中的全部虫卵数。将虫卵数乘以24，再乘以粪便性状系数，即为每克粪便虫卵数。并根据排便量和常见蠕虫的每条雌虫每天的排卵数 计算出虫荷。其他注意事项同厚涂片透明法。 常见蠕虫每条雌虫每日排卵数估计 饱和盐水浮聚法检查线虫卵 此法利用某些蠕虫卵的比重小于饱和盐水，虫卵可浮于水面的原理。此法适用于检查各种线虫卵，尤以检查钩虫卵的效果最好，也可检查带绦虫卵和微小膜壳绦虫卵，但不适宜检查吸虫卵和原虫包囊。蠕虫卵及原虫包囊的比重见下表。 蠕虫卵及原虫包囊的比重 用竹签挑取黄豆大小 粪便置于盛有少量饱和盐水浮聚瓶内，也可用青霉素小瓶代替， 将粪便充分捣碎并与盐水搅匀后，加饱和盐水至瓶口，用竹签挑取浮于水面的粪渣，再慢慢加饱和盐水至稍高于瓶口而不溢出为止。在瓶口轻轻覆盖一载玻片，注意勿使产生气泡；如有较大气泡，应揭开载玻片加满饱和盐水后再覆盖之。静置15分钟后，将载玻片提起并迅速翻转，置镜下观察 饱和盐水的配制：烧杯中盛有清水煮沸后，慢慢加入食盐并不时搅动，直至食盐不再溶解为止，冷却后的液体即为饱和盐水。100 ml沸水约加食盐3540g 。 饱和盐水浮聚法 自然沉淀法检查蠕虫卵 此法主要用于蠕虫卵的检查，蠕虫卵比重大于水，可沉于水底，使虫卵可集中，并经过水洗后，视野较清晰，易于检出，但较费时。比重较小的钩虫卵效果较差，但比重大的原虫包囊也可用此法。 取粪便2030g ，加水调成混悬液，经60 目铜筛过滤于500 ml 三角量杯内，用水冲散粪渣，再加水至离杯口2cm 处，静置2030 分钟，缓缓倒去上液，加满清水后，再次沉淀，如此重复23 次，最后倾去上液，吸取沉渣涂片镜检。若检查原虫包囊，则每隔6小时换水1次，使包囊充分沉于水底。 自然沉淀法 钩蚴培养法 亦称试管滤纸培养法。在适宜的温度和湿度的条件下，钩虫卵在数日内发育并孵出幼虫，一般在35 天后，可用肉眼或放大镜观察，检出率为直接涂片法的7 倍，也优于饱和盐水浮聚法，孵出的丝状蚴可作虫种鉴定。 取1cm ×10cm 的洁净试管1 只，加冷开水约15 2 ml 。将滤纸剪成与试管内径等宽但略短于试管长度的“T” 字型，上端用铅笔写上受检者姓名或编号、受检日期。用竹签挑取约04g 粪便均匀涂于滤纸中24 处， 上、下各14 处不涂粪便。将滤纸沿管壁插入试管内，使滤纸下端空白处的12 浸入水中，勿使粪便接触液面，置于2530温箱中孵育。每天沿管壁添加少量清水， 以保持液面高度。3 天后， 可见试管底部有作蛇样运动的钩蚴。如无钩蚴，可继续培养观察至第5 天。如需作虫种鉴定应从管底吸出钩蚴镜检，气温较低时可将试管放入温水 中数分钟后，再作检查。 钩蚴培养法 此法亦可用于分离人体消化道内各种阿米巴滋养体和肠道滴虫滋养体，检出率较高，但每管粪便量需10g ，培养2 4 天。检查肠道各种原虫，仍应结合包囊碘液染色检查 肛门拭子法与肛周蛲虫检查法 此法是根据雌性蛲虫在人体肛门周围及会阴部皮肤产卵，带绦虫孕节从肛门排出或主动逸出过程中破裂、虫卵粘附于肛门周围皮肤上的特性而设计的，对这两种虫体的检出率远比其他粪便检查为高。一般在清晨醒后或午睡后、便前、洗澡前进行检查，如首次检查阴性，可连续检查23 天。常用方法有棉签拭子法和透明胶纸法： 1棉签拭子法 先将棉签浸入生理盐水中，取出后挤去过多的盐水，用棉签在受检者肛门周围和会阴部皮肤擦拭，然后将棉签放入盛有饱和盐水的试管或青霉素小瓶中，充分搅动，使虫卵洗入盐水中，迅速提起棉签，在试管内壁挤去盐水后弃之。再加饱和盐水至管口，并按饱和盐水浮聚法操作检查。也可将擦拭肛周皮肤的棉签放人盛有清水的试管中，充分浸泡后，提起棉签在管壁内挤去水分后弃之。试管静置10分钟，或离心后，倒去上液，取沉渣镜检。 2透明胶纸法 用宽1018cm 透明胶纸剪成长约6cm的小段，一端向胶面折叠约04cm 后，再贴在洁净的载玻片上。载玻片的一端贴上标签， 并注明受检者姓名或编号等。检查时揭下胶纸，清晨便前用胶面粘贴患者肛周皮肤，然后将胶纸复位贴在载玻片上、镜检。如胶纸下有较多汽泡，可揭开胶纸加一滴生理盐水或二甲苯，覆盖胶纸后镜检 透明胶纸法 3成虫检查 雌性蛲虫常在宿主睡眠期间爬出肛门产卵，可在肛门周围被检获。对于儿童，可在睡眠1小时后或肛门瘙痒惊醒时，暴露其肛门，仔细观察肛门周围皮肤，若发现白色小虫，可用透明胶纸粘附后贴于载玻片上镜检。也可用镊子夹入有生理盐水的小瓶内，蛲虫会产卵于生理盐水中再将此虫转入有70 酒精的小瓶内， 虫体被固定后作进一步鉴定，虫卵形态更有助于虫种鉴定。对疑有蛲虫感染的成人，可在晨醒后、便前，或肛门有异物瘙痒感时，暴露肛门，按上述方法进行检查 粪便虫体检查法 此法包括淘虫检查法和带绦虫孕节检查法，前者常用于驱虫疗效考核，后者可作为带绦虫的病原检查和虫种鉴定。 1淘虫检查法 取患者服药后2472小时的全部粪便， 加水搅拌， 用40 目铜筛或纱布滤出粪渣，经水反复冲洗后，倒在盛有清水的大玻璃器皿中，器皿下衬以黑纸，检出混杂在粪渣中的虫体进行鉴别。 2带绦虫节片检查 猪带绦虫或牛带绦虫的孕节可从链体上脱落，随粪便排出体外或主动逸出肛门，或服药后驱出虫体。粪便中的虫体可采用淘虫法后，或直接取出节片用清水洗净， 置于两载玻片之间，轻轻压平，对光观察虫体结构鉴定虫种。如是孕节片可根据子宫分支情况直接鉴定，也可用小号针头连接结核菌素注射器，从孕节后端正中处生殖孔的位置插入子宫，徐徐注入墨水汁或卡红染液，用手指轻压使染液分布于侧支中。拔出针尖后，洗去节片表面粘附的染液，子宫分支显现黑色或红色，便于观察、鉴别。 卡红染液配制：钾明矾饱和液100 ml，卡红3g ，冰醋酸10 ml。混合液置于37温箱内过夜，过滤后即可使用 铁苏木素染色法 此法主要用于各种阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫滋养体和包囊的染色鉴定。 用竹签挑取粪便少许，按一个方向在洁净的载玻片上涂成薄粪膜，立即放入60的肖丁固定液2分钟。依次将标本放入碘酒精、70及50酒精中各2分钟，用自来水和蒸馏水各洗1次。再置于40 2铁明矾溶液2分钟，流水冲洗2分钟，放入40 05苏木精溶液中染色510分钟，再流水冲洗2分钟，放入冷2铁明矾溶液中退色2分钟。将载玻片置显微镜下检查退色情况，如颜色偏深，应继续退色，直至核膜、核仁均清晰可见为止。然后，流水冲洗1530 分钟， 至标本显现蓝色，再用蒸馏水洗1次。继而，依次在50、70、80、95酒精中逐渐脱水各2分钟。在二甲苯中透明35 分钟后用中性树胶封片。染色后，原虫胞质呈灰褐色，胞核、包囊内的拟染色体及溶组织内阿米巴滋养体吞噬的红细胞均被染成墨色，糖原泡则被溶解呈空泡状。 苏木精染液的配制：苏木精粉10g，溶于95酒精100 ml 中，装入250 ml 大口玻瓶内，加塞置室温中68 周，使之充分氧化。如将玻瓶晒于阳光下，每日振摇，可加速成其氧化，便于应急使用。氧化成熟的染液滴于水中呈鲜艳紫色，未氧化成熟染液则呈淡红或红紫色。此为原液，使用时，按119 加蒸馏水配成05染液，此染液可保存36个月。 碘酒精配制：先用碘化钾10g 溶于100 ml 蒸馏水中，再加结晶碘5g，溶解后贮于棕色瓶中，该液即为卢戈碘液。在70酒精中加数滴卢戈碘液即为碘酒精。2铁明矾溶液配制：硫酸铁铵2g，溶于100 ml 蒸馏水中，临用前配制。 肖丁固定液配制：饱和氯化高汞水溶液2份加95酒精1份配成100 ml ，用前再加冰醋酸5 ml，并加热至40 溶组织内阿米巴培养 当受检者疑有溶组织内阿米巴感染，而直接粪便检查为阴性时，可作阿米巴人工培养，培养方法有常规培养、有菌培养和无菌培养。 常规培养 取脓液、粘液处稀便05 ml，或黄豆大小的成形便，直接接种至试管内与培养液混匀；或将粪便自然沉淀后，取沉淀物05 ml 接种至试管内。置试管于37温箱中培养，培养后24小时、48小时、72小时取培养液中的混浊部分涂片镜检， 查出虫体即可确诊。 常用的培养基有营养琼脂双相培养基和洛克氏液鸡蛋血清培养基： 1营养琼脂双相培养基 分固相和液相两部分： 固相部分：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，琼脂15g，NaCl8g，蒸馏水1000 ml。 液相部分：NaCl 8g，KCl 02g，CaCl2 02 g，M gCl2 001g，Na2HPO4 2g，KH2PO4 2g，蒸馏水1000 ml 。 配制液相部分，KCl 和CaCl2各加少许蒸馏水分别另装小瓶，高压灭菌，冷却后再合并在一起。固相部分的各成分经沸水浴23 小时完全溶解后，趁热分装试管，每管5 ml，加棉塞，高压灭菌后置成斜面，冷却后放入4 冰箱备用。接种前每管加液相部分45 ml，灭活小牛血清05 ml，米粉20 mg，青霉素、链霉素各1000 Uml 。 2洛克液鸡蛋血清培养基 培养基成分：洛克液70 ml，灭活马血清，米粉，鸡蛋4个。先配制洛克液：NaCl 90g 、CaCl2 02g、KCl 04g、NaHCO3 02g、葡萄糖25g、蒸馏水1000 ml，高压灭菌。鸡蛋用肥皂水刷洗，再用70酒精抹洗后，破壳装入有70 ml洛克氏液烧瓶内，加玻璃珠充分摇动，分装至消毒试管内，每管约5 ml，斜置并加热至70 1h使之凝固为斜面，翌日再高压消毒20分钟。接种前每管加洛克液45 ml，马血清05 ml，无菌米粉20 mg，青霉素、链霉素各1000 Uml 。 有菌培养 在含有琼脂斜面的6 ml 有螺旋盖的培养管中加入10 mg米粉、120l红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和BRS液41混合液，加入约50 mg粪便、混匀。37培养24小时，倾去培养上清液，再加入适量41 混合液、少量米粉和60 l 红霉素液。37再培养48小时后，取米粉与粪渣混合物一滴，以碘液染色或直接观察有无滋养体。若未发现虫体，再加入米粉后，继续培养24小时。若有虫体可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续转种培养。这种有菌培养方法也可培养结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴和哈门氏内阿米巴等多种阿米巴。其培养基组成是： 1琼脂斜面 15g 琼脂和75g 氯化钠溶于1000 ml 蒸馏水中，取152 ml 盐水琼脂置于6 ml 培养管中高压灭菌，当冷却至75左右倾放使其形成斜面。 2红霉素溶液 在无菌容器中加入20 ml 70酒精、再加05g 红霉素粉剂溶解后，在4放置2小时以上，然后加灭菌水至50 ml 。 3米粉 大米粉高压消毒 或180干燥灭菌。 4BRS 溶液 NaCl 50g 、2SO4 10g、柠檬酸20g、MgSO405g、KH2PO4 5g、乳酸4 ml，加水至950 ml，调节p H 至70，最终调节容量至1000 ml，分装高压灭菌，制备成贮存液。使用时将100 ml 贮存液加入850 ml 双蒸水，调节p H70分装高压灭菌，即为R溶液工作液。25 ml R溶液工作液与1个克隆大肠杆菌，37 振摇培养48小时，即为BR溶液。在BR溶液中加入等量血清，继续培养2448小时，即为BRS溶液。 无菌培养 无菌培养主要用于溶组织内阿米巴的克隆培养，是在有菌培养的基础上，将虫体转种至无菌培养基中，使其逐渐转为无菌培养，并可进一步克隆化。由于虫体对培养基的要求甚高，难度较大，一般不用于临床检验 隐孢子虫卵囊染色检查 目前最常用的方法是金胺酚改良抗酸染色法，该法是采用金胺酚染色法和改良抗酸染色法复染，以提高检出率和准确性。单用金胺酚染色法或改良抗酸染色法，其效果均不如复染方法。检查时，取患者腹泻的新鲜粪便或经10 福尔马林固定保存粪便，自然沉淀后用吸管尽可能取底部粪便，于载玻片上涂成粪膜，晾干后先用金胺酚染色，再用改良抗酸染色法复染。 金胺酚染色法 1染液配制 lgL金胺酚染色液：金胺1g，石炭酸50g，蒸馏水100 ml ；3盐酸酒精：盐酸3 ml，95酒精100 ml ；高锰酸钾液：高锰酸钾05g，蒸馏水100 ml 。 2染色步骤 滴加第一液于晾干的粪膜上，1015 分钟后水洗；滴加第二液，1分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗；待干后置荧光显微镜下观察。 低倍荧光显微镜下，可见卵囊为一圆形小亮点，呈现乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色，卵囊壁为一薄层，多数卵囊周围深染，中央淡染，似环状；或深染结构偏位，有些卵囊全部为深染；但有些标本可出现非特异的荧光颗粒，应注意鉴别。 改良抗酸染色法 1染液配制 石炭酸复红染色液： 碱性复红4g，95 酒精20 ml，石炭酸8 ml，蒸馏水100 ml ；10 硫酸溶液：纯硫酸10 ml，蒸馏水90 ml ；20gL 孔雀绿液：20gL 孔雀绿原液1 ml，蒸馏水10 ml 。 2染色步骤 滴加第一液于粪膜上，1510 分钟后水洗； 滴加第二液，110 分钟后水洗；滴加第三液，1 分钟后水洗；待干后置显微镜下观察。染色后，卵囊为玫瑰红色，圆形或椭圆形，背景为绿色。染色 和脱色时间短，卵囊内子孢子边界不明显；染色时间长，脱色时间相应延长时，子孢子边界明显，卵囊和子孢子均被染成玫瑰红色，子孢子呈月牙形，共4个，其他非特异颗粒则染成蓝黑色，容易与卵囊区分。 不具备荧光显微镜的实验室，可染色后先在光镜低、高倍镜下过筛检查，见有小红点时再转用油镜观察，这样可提高检出速度和准确性。 金胺酚改良抗酸染色法 先用金胺酚染色后，再用改良抗酸染色法复染，然后置光镜下观察。卵囊同改良抗酸染色法所见，但非特异性颗粒被染成蓝黑色，两者颜色显然不同，极易区别，使检出率和准确性都明显提高