槐花米中芦丁.docx

槐花米中芦丁天然药物化学实验 槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定 芦丁广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。 槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。 芦丁又名芸香苷，是由槲皮素3位上的羟基与芸香糖为葡萄糖与鼠李糖组成的双糖脱水合成的苷。为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174178，无水物188190。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用作防治高血压病的辅助治疗剂。现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。 一、实验目的 1学习黄酮化合物的提取分离方法。 2学习芦丁的一种提取、精制方法 3. 学习黄酮甙水解生成甙元的方法及二者之间的分离。 4熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法和层析鉴定方法。 二、实验原理 本实验主要是利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行提取分离精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。 三、实验材料 槐米、2的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、1的氢氧化钠溶液、1的三氯化铝乙醇溶液、1的葡萄糖溶液、1的鼠李糖溶液、1芦丁乙醇溶液、1槲皮素乙醇溶液、95乙醇、碳酸钡、广泛pH试纸、硅胶等。 研钵，烧杯 500ml，脱脂棉，漏斗，500ml磨口圆底烧瓶，长玻璃棒，布氏漏斗，滤纸，250ml圆底烧瓶，冷凝管，电热帽，称量纸 四、实验内容 提取： 称取槐花米15g，在研体中研碎，放入烧杯中，加入250ml沸水，煮沸45min，不断补加挥发掉的水，经棉花过滤，滤渣以200ml水煮沸30min，再滤过，合并两次提取液，放置，析出沉淀，倾出上清液，抽滤沉淀， 槐米粗粉 沸水煮沸3045分钟，反复2次 趁热滤过 水提取液 药渣 放冷 沉淀析出 抽滤 芦丁粗品 精制： (1)将粗制芦丁研细，加95%乙醇回流溶解趁热过滤，取1/2滤液浓缩至原体积的1/3-1/4，放置，析出结晶，抽滤，干燥称重，得精制芦丁，计算得率 (2)将芦丁粗品悬浮于蒸馏水中，煮沸至芦丁全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分钟，趁热抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤至干，置空气中晾干，或6070干燥，得精制芦丁，称重，计算得率。 芦丁的水解： 取芦丁1g，研碎，加2硫酸水溶液80ml，小火加热，微沸回流30-60min，并及时补充蒸发掉的水分。在加热过程中，开始时溶液呈浑浊状态，约10min后，溶液由浑浊转为澄清，逐渐析出黄色小针状结晶，即水解产物槲皮素，继续加热至结晶物不再增加时为止。抽滤，保留滤液20ml，以检查滤液中的单糖。所滤得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70乙醇80ml加热回流使之溶解，趁热抽滤，放置析晶。抽滤，得精制槲皮素。减压下110干燥，可得槲皮素无水物。 (四) 芦丁、槲皮素及糖的检识 1颜色反应 -萘酚-浓硫酸试验： 取芦丁少许置于试管中，加乙醇1ml振摇，加-萘酚试剂23滴振摇，倾斜试管，沿管壁徐徐加入0.5ml浓硫酸，静置，观察两层溶液界面变化，出现紫红色环者为阳性反应，表示试样的分子中含有糖的结构，糖和甙类均呈阳性反应，比较芦丁和槲皮素的不同。 盐酸-镁粉试验： 取芦丁少许置于试管中，加5乙醇2ml，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。观察并记录颜色变化。 三氯化铝试验： 取芦丁少许置于试管中，加乙醇4ml，在水浴中加热溶解。取一张滤纸，分别滴加两滴芦丁的乙醇溶液，然后其中一个加1%的三氯化铝醇溶液两滴，紫外灯下观察荧光变化。 氨水试验： 取3中配制的芦丁乙醇溶液，取一张滤纸，分别滴加两滴芦丁的乙醇溶液，将滴有供试液的部分分别倒扣在盛有氨水的瓶口，观察颜色变化。 3色谱检识 (1)槲皮素和芦丁的薄层鉴定 硅胶薄层色谱 样品：a精制芦丁 b芦丁标准品 c精制槲皮素 d 槲皮素标准品 吸附剂：硅胶G，105下活化2h 展开剂： CHCl3MeOHHCOOH 显色剂：1%AlCl3乙醇溶液喷雾，干后紫外灯下观察 (2) 糖的纸色谱检识：取上述芦丁水解后的母液20ml，加入氢氧化钡细粉中和至pH7，滤除生成的硫酸钡沉淀。滤液中水浴中浓缩至12ml，供纸色谱点样用。 支持剂：新华层析滤纸 样 品：水解浓缩液 对照品：a. 葡萄糖标准品水溶液 b. 鼠李糖标准品水溶液 展开剂：正丁醇：冰醋酸：水 显 色：a. 喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105加热10min，显棕色或棕红色斑点 b.喷氨性硝酸银试剂，于100左右加热，呈棕褐色斑点。 芦丁的HPLC 采用反相高效液相色谱法： C18柱，流动相：乙腈-水，检测波长：257nm，柱温：30oC，流速：1.0ml.min-1 对照品溶液的配制：精密称取芦丁对照品10mg左右，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，作为储备液，精密量取储备液适量于10ml容量瓶中，甲醇定容，配制浓度为15ug/ml的芦丁样品液。 五、实验说明及注意事项 1本实验采用利用芸香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。又报道将生产工艺改进为95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后将粗浸膏经除去脂溶性杂质后，用水洗净，过滤，干燥即得芸香甙，可提高收率696%，并降低了成本。因此可根据不同原料采用各种不同方法提取。在提取前应注意将槐米略捣碎，使芦丁易于被热水溶出。 3另外还可以采取碱溶酸沉法，槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使生成钙盐沉淀除支。pH应严格控制在8-9，不得超过10。因为在强碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香甙水解破坏，使提取率明显下降。酸沉一步pH为2-3，不宜过低，否则会使芸香甙形成盐溶于水，降低了收率。 4槲皮素以乙醇重结晶时，如所用的乙醇浓度过高，一般不易析出结晶。此时可于乙醇溶液中滴加适量蒸馏水，使呈微浊状态，放置，槲皮素即可析出。 六、思考题 1本实验提取过程中应注意哪些问题？ 2根据芦丁的性质还可采用何种方法进行提取？简要说明理由。 3怎样确定芦丁结构中糖基是否联结在槲皮素3-O位上？ 4怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖及一个鼠李糖？ 5UV在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 6.提取总黄酮时为何要降沸水加至槐花米中而不是将槐花米直接加入冷水中逐渐升温加热：能否有其他方法起同样的作用？