植物基因组提取及DNA的浓度测定.docx

植物基因组提取及DNA的浓度测定植物基因组提取及DNA的浓度测定 一、实验目的 1、 掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。 2、 学习利用紫外分光光度计法测定DNA溶液的浓度。 二、实验原理 三、实验步骤 1、2%CTAB抽提缓冲液在65摄氏度水浴中预热，与此同时，用剪刀、镊子取8片约0.2g的子叶于研钵中，放在冰水研至匀浆状。 2、用移液器向研钵中加入700微升2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅拌。然后将研磨液倒入1.5ml的灭菌离心管中，再置于65摄氏度的恒温水浴锅中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出。 3、冷却2min后，用移液器吸700微升的氯仿/异戊醇到离心管中，剧烈振荡23min，使两者混合均匀。 4、与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心10min，与此同时，将60微升的预冷的异丙醇加入另一个新的灭菌离心管中。 5、移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异戊醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能看到DNA絮状物。 6、同样，与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机中，10000r/min离心1min，然后立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出。 7、将离心管倒立于滤纸上1min，直立离心管，加入720微升的75%的预冷的乙醇及80微升5mol/L的乙醇钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中。放置10min，使DNA块状物的不纯物溶解。 8、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心1min，倒掉液体，再加入800微升75%乙醇，将DNA再洗2min。 9、与另一组同学的平衡，对称放入离心机，10000r/min离心30s，立即倒掉液体，将离心管倒立于滤纸上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA。 10、加入50微升0.5XTE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37摄氏度恒温箱中约1.5h，消化RNA。 11、取2.99ml蒸馏水至一干净的试管，再加入上述DNA溶液10微升，混匀。 12、先3ml蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，比较两杯差异，然后倒掉其中一杯蒸馏水，加入3ml已稀释的DNA溶液，测定260nm及280nm的光吸收值。 注意事项： 1、 镊子、剪刀、研钵、子叶都得用酒精消毒。 2、 叶片磨得越细越好。 3、 移液器使用时，要注意量程，枪头加同一液体且没被溶液污染时，可重复使用，加入不同液体或被溶液污染时，要换枪头。 4、 吸取含DNA时要用剪短的枪头，减少机械切割力对DNA的破坏。 5、 移液器使用时要始终保持竖直，或稍微倾斜，不可平拿，甚至倒过来，防止液体进入移液器中，污染移液器。 6、 紫外分光光度计要预热。 7、 紫外分光光度计打开盖，使指示灯指向T，使透光率为0，盖上盖，使透光率为100%，然后使指示灯指向A,进行测量。 8、 要比较两杯的差异，提高结果的准确性。 四、实验结果 装溶液的比色杯与另一个比色杯的差值 溶液 溶液的最终值 A260 0.005 0.118 0.113 A280 0.004 0.054 0.05 A260/A280=0.113/0.050=2.26 dsDNA=50*(A260)*稀释倍数 =50*0.113*300 =1695微克/ml 分析： 1、 采用机械研磨的方法，可破坏植物的组织和细胞，为了防止匀浆中各种酶类，抽提缓冲液中的B-巯基乙醇可降低这些酶类的活性，同时，在冰上研磨，有两方面的作用：、降低酶的活性，、使细胞中水结晶，细胞膨胀，利于材料的破碎。 2、 CTAN表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。 3、 抽提缓冲液中的EDTA为金属螯合剂，能除去匀浆液中的Mg2+和Mn2+，抑制DNA酶的活性。 4、 抽提缓冲液中的Nacl浓度很高，DNP易溶于高盐溶液，RNP在高盐溶液中溶解度不大，以分离DNP和RNP。 5、 氯仿能使蛋白质变性，同时有吸收匀浆液中色素的作用。异戊醇防止液相之间起泡，利于液相分离。这样DNA溶于上层CTAB抽提液中，细胞碎片在下层，变性蛋白质在中间。 6、 第2步的轻轻振荡，是为了防止DNA受破坏，第3步的剧烈振荡是为了DNP中蛋白质与DNA的分离。 7、 异戊醇一方面：除去CTAB，因为CTAB易溶于异丙醇，另一方面：沉淀DNA。 8、 离心后那可除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入预冷的乙醇使DNA沉淀，因为DNA难溶于乙醇冷的乙醇效果更佳。 9、 最后的TE缓冲液中含RNA酶，消化RNA。 10、 抽提缓冲液中Tris-Hcl使DNA保持天然的完整状态。 11、 DNA的吸收光谱峰在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的A值，当A260=1时，双链DNA含量约为50微克/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处。如果A260/A280在1.8-2.0时，认为以达到较高的纯度，如低于此值其中蛋白质较多，如高于此值说明其中含RNA或DNA片段过多。 12、 本实验A260/A280=2.26>2.0，很可能是DNA片段过多，因为本实验第5步没用剪短的枪头。 13、 比较两比色杯的差异，是因为比色杯可能不标准，会产生小的误差，通过记录两者的差异，然后通过结果相减可消除这种差异造成的影响。 14、 DNA溶液的浓度可用dsDNA=50*(A260)*稀释倍数来算。