醋酸纤维薄膜课件.ppt

一、实验目的,学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 了解电泳技术的一般原理,二、实验原理,任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。如氨基酸、蛋白质、酶、核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。,一般在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。,泳动度,不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用泳动度或迁移率来表示。泳动度指带电质点在单位电场强度下的泳动速度。v d/t dl u=（cm2.V-1.S-1)E V/l Vt,影响泳动度因素,带电质点的性质 质点所带净电荷的量、质点的大小及质点的形状。一般说来质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快；反之则越慢。,溶液的粘度电场强度溶液的pH值溶液的离子强度固体支持物的电渗现象,本实验用醋酸纤维薄膜，是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维纤维素醋酸酯。具有泡沫状的结构，厚度均为120um，有很强的渗透性，对分子移动阻力很小。,三、器材与试剂,醋酸纤维薄膜 2*8cm 常压电泳仪点样器：用盖玻片代替。培养皿玻璃板粗滤纸电泳槽巴比妥缓冲液：pH8.6，离子强度0.07 巴比妥2.76g,巴比妥钠15.45g，加水至1000ml。每个大组500ml,染色液 每个大组200ml 氨基黑10B0.25g,甲醇50ml,冰醋酸10ml,水40ml（可重复使用）漂洗液 每个组100ml 含甲醇或乙醇45ml、冰醋酸5ml、水50ml透明液 每个组200ml 含无水乙醇：冰醋酸7：3，本实验不做定 量不用配。,四、操作方法,1、薄膜准备：用镊子取醋酸薄膜一张，放在绥冲液中浸泡20分钟。（识别光泽面与无光泽面，并在有光泽面一角做记号）2、制造滤纸桥：剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中，用缓冲液润湿并驱赶气泡，使滤纸紧贴在支架上。如图,3、点样：取出膜条，用双层滤纸吸干多余的液体，平铺在玻璃板上，无光泽面朝上，用点样器蘸取血清在膜条的一端1.5cm处，均匀划一条线。4、电泳：在两电极槽内加入等高的缓冲液，将膜条平悬于滤纸桥上（点样端靠近负极），盖严电泳室通电，电压120V，电流0.4-0.7mA/cm 膜宽，电泳60分钟。,5、染色：电泳完毕后，取膜条放在染色液中浸泡10分钟左右。6、漂洗：漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的图谱。保存。7、透明：将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡2-3分钟后取出贴于洁净的玻璃板上，干后放在两层滤纸中保存。8、计算：计算出每条蛋白的泳动度。,注意事项,手尽量不要接触膜条。用点样器点样时不要点的太多，但也不 能太少。线条均匀，用力水平。电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液。,五、实验结果,六、结论与分析,