标记免疫分析课件.ppt

7.3 标记免疫分析,针对抗原-抗体反应缺乏高灵敏的定量检测信号的缺点，人们发展了在分析体系中引入探针系统-标记技术的方法，从而开创了微量和超微量分析的新天地。标记免疫分析是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原-抗体反应，从而间接测定微量的抗原或抗体。,作为一种分析技术，标记免疫分析最早建立于1954年，它是由美国科学家R.S.Yallow和S.A.Berson利用放射同位素125I标记胰岛素，并使其与血浆中游离的胰岛素共同竞争有限的胰岛素抗体的特异性结合位点，最终形成的放射性抗原-抗体复合物与待测物含量呈线性负相关，应用-或-计数器进行检测，这种方法称为放射免疫分析法。该方法在当时及其随后的20年中是生物分析检测中最重要的成就，R.Yallow由此于1977年获得了诺贝尔奖。,近年来标记免疫分析飞速发展，应用不同的标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷。常用的标记物有放射性同位素、酶、荧光素、化学发光试剂、镧系稀土元素等。与这些标记物相对应的免疫分析方法分别称为放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光免疫分析法（FIA）、化学发光免疫分析法（CLIA）、时间分辨荧光免疫分析法（TrFIA）等多种。,根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的标记抗原或标记抗体，标记免疫分析又分为异相标记免疫分析和均相免疫分析两大类。7.3.1 异相标记免疫分析的基本原理 异相标记免疫分析是一种需要在检测前分离游离的标记抗原或标记抗体的方法，它是医学检验中常用的方法。,尽管目前已发展了许多涉及异相标记免疫分析的方法，在原理上它主要包括两种：其一是利用标记抗原与待测抗原共同竞争有限的抗体结合位点的竞争结合免疫分析；其二是标记抗体过量的非竞争性免疫分析。这些方法均有商品化试剂盒和自动化检测仪器。,一、竞争结合免疫分析 这一技术的基本原理是固定抗体的量，通过待测抗原与标记抗原间的竞争，获得可测定的免疫复合物，检测信号与待测抗原浓度成反比。任何可逆的特征键合蛋白质或细胞受体均可用此法进行分析测定。其过程可用下式表示：,Ag AgAb+Ab(7.3)Ag*Ag*Ab,k1,k2,其中标记抗原Ag*与抗体Ab的浓度或总量是固定已知的，达到平衡时与抗体结合的标记抗原Ag*的量与样品中抗原Ag的量成反比。利用标准曲线法可以测出待测抗原的量。当然在检测前需分离游离的标记抗原。,二、非竞争免疫分析 利用过量的标记抗体与待测抗原形成抗原抗体免疫复合物。由于抗体过量，所有待测抗原均形成络合物，无需建立反应平衡：,Ag+Ab*AgAb*+Ab*(7.4),形成的复合物与Ag浓度成正比。最后，分离已复合的Ab*和游离的Ab*进行测定。,7.3.2 均相免疫分析 均相法的最大特点是结合和未结合的抗原或抗体不需物理分离过程即可直接测定，使标记免疫分析更方便地实现自动化。最常用的体系是酶放大免疫技术（EMIT），这一方法对小分子（半抗原）如药物的测定特别有用。,用酶标记抗原后，酶保持它的生物活性。当酶标抗原与抗体反应后，酶的活性由于空间立体阻碍或构象改变而被抑制（图7.7）。这种抑制随着游离抗原浓度的增加而减弱，因而酶的活性及其催化产物所给出的信号也就越强，利用标准曲线可测定抗原浓度。,图7.7 酶放大免疫技术检测原理示意图,另一个均相免疫分析体系是利用磷光偏振技术，又称荧光偏振免疫分析（FPIA）。荧光物质经一平面的偏振光照射后，可跃入激发态，当其释放能量回到基态时，便发出偏振荧光。荧光偏振强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比。分子越大，旋转越慢，发出的偏振光越强。荧光偏振免疫技术中偏振光强度的变化如图7.8所示。,例如，将荧光素标记的小分子药物和待测药物一起与该小分子药物的抗体混合。若体液中待测未标记的小分子药物浓度低，则标记的药物分子与抗体结合的就多，由于抗体分子大，所形成的荧光素标记的药物分子与抗体的结合物体积亦大，旋转减慢，荧光偏振光强度就高。反之，荧光偏振光强度就低。利用所产生的荧光偏振信号与待测物浓度成反比，通过标准曲线可以进行定量分析。,图7.8 FPIA原理示意图,7.3.3 放射免疫分析 如前文所述，放射免疫分析（RIA）是最早建立的标记免疫分析方法，它是将同位素标记技术与抗原抗体反应相结合的一种微量分析方法，广泛用于激素、药物、细胞因子、抗体、肿瘤标志物等化合物的定量分析，检测范围可达10-910-12 ng mL-1，是灵敏、可靠的免疫分析方法之一，现已有300多种微量物质用此法测定。,常用来标记抗原或抗体的同位素有125I，131I，3H和35S。放射活性检测用液体闪烁计数，固相体系则用X射线胶片显影。在临床上将利用放射同位素标记抗原通过竞争法原理进行测定的方法称为放射免疫分析（RIA），而将放射性同位素标记抗体，利用夹心法检测的方法称为免疫放射分析（IRMA）。,放射免疫分析的原理是用已知的标记抗原与标本中可能存在的抗原竞争一定量的已知抗体，分别形成标记的抗原抗体结合物（B）和无标记的抗原抗体结合物（F）。然后将两者分离，并根据测得的放射性强度，算出结合率B/（B十F），它与标本中抗原的量成反比。实验时除作标本检测外，还要以不同浓度的已知抗原参与反应得到的数据给出竞争抑制曲线，作为定量分析的依据。,免疫放射分析是将抗体固定在管壁或载体上，待测抗原与固定抗体反应后，倒掉反应液，生成物抗原-抗体复合物留于管底或固定相载体上，再加入标记抗体，在固相上形成抗原-抗体-标记抗体的复合物，洗涤后测定放射性强度，从而推算出标本中抗原的含量。这种形成抗原-抗体-标记抗体的复合物的免疫检测方法又称为夹心法，它是固相免疫法的一种，其原理如图7.9所示。,图7.9 利用夹心法进行检测的免疫放射分析流程图,标记抗原的放射性同位素有：1H、14C、131I和125I。H和C的标记较为复杂，而I的标记比较简单，且131I和125I的半衰期分别是8.05天和60天，无论是检测还是后处理都合适，故在应用中最常用的是放射性125I的射线（0.035 meV）。尽管放射免疫分析具有诸多优点，且易于制成配套试剂盒，实现自动化检测，并已成为颇具权威性的分析方法，但由于放射性同位素的使用带来了污物处理的难题，不仅有可能损害操作人员的健康，而且限制了“试剂”的寿命，难以获得长期稳定的检测标准，在RIA方法的启发下，陆续发展了一系列非放射性的标记免疫分析方法。,7.3.4 酶联免疫分析 1966年Engrall等人将抗原抗体免疫反应和酶的高催化作用相结合，用特定的酶标记抗原或抗体，酶催化底物的显色程度，对待测物进行定性或定量测定，建立了酶免疫分析法（EIA）。目前，常用的EIA法是酶联免疫吸附测定法（ELISA），其检测原理如图7.10所示。,图7.10ELISA的检测原理,方法之一是将抗原或抗体吸附于固相载体上，分别加入检样和酶标抗体或酶标抗原进行竞争反应，而后利用酶催化其底物显色反应来进行检测。该方法又称直接法，可用于检测大分子抗原和小分子抗原，也可用于检测抗体，显色的深浅与标本中待测抗原或抗体量成反比。以测定抗原为例，待测样品中的抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测抗原含量越多，能与固相抗体结合的酶标抗原就越少，则显色越浅。,在检测抗体时，将抗原包被于固相载体，加入待测血清反应后，洗去未参与反应的无关蛋白成分后，加入酶标记的抗体（如酶标抗人IgG作为第二抗体）或酶标记的抗原，使其与固相载体上抗原待测抗体复合物反应，在固相载体上形成抗原待测抗体酶标记抗体（或抗原待测抗体酶标记抗原）的复合物，加入底物后，利用显色反应进行检测，此法即为间接法。其中使用酶标记抗原的方法又称为双抗原夹心法，它可避免检样中多种物质的干扰而产生假阳性反应。,由于酶联免疫吸附测定的仪器设备价格低廉、操作简便、酶对人和环境基本无污染，因此在免疫标记技术中，该法应用最广泛。在原有方法基础上对酶标技术加以改良，使众多新方法如生物素一亲和素放大系统（biotin-avidin system，BAS）和双表位ELISA应运而生。生物素一亲和素放大系统将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲和力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。,7.3.5 荧光免疫分析法 用荧光物质作标记物的免疫分析方法称为荧光免疫分析法（FIA）。早期的FIA建立于1942年，Coons等用异硫氰荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于此种荧光物质标记物的性能较差，未能推广使用，直至20世纪50年代末，Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（FITC），并由Marshall等在1958年对标记抗体的FIA进行了改进，才使免疫荧光技术逐渐推广应用。,荧光是由荧光物质的分子吸收光能，而后释放能量，并发出一种较长波长的光。当一束光投射到荧光物质上，其电子被激发到较高的能量水平。而后被激发的荧光物质释放光子而回复到初始状态。在这个过程中丢失了一部分能量，因而释放的光子比激发光的波长更长。前后二者波长之差是荧光物质的特征，称为stokes位移。,荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。适用于抗体标记的荧光素通常是环状化合物，具有共轭结构。共轭体系越大，被激发的分子稳定性越大，即荧光增强；分子平面性和硬度越大，荧光倾向较大。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）及四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）。,荧光物质可在室温下使用，荧光可采用常见的、相对较便宜而无害的方法来检测。此外，结合物在一般贮存条件下性能稳定，可保存使用较长时间，因此该方法经济、安全、测定简便。但背景的干扰限制了它的灵敏度，无法与RIA相比。近年来，定量测定体液中抗原或抗体的荧光免疫分析方法随着一系列新仪器和新方法的建立，得到很大改进和发展。,人们根据生物背景荧光寿命短（ns级）的特点，提出了选择长寿命的荧光物（稀土元素镧系元素）作为标记的时间分辨荧光免疫分析法（TrFIA），使免疫荧光分析技术的标准化、定量化和自动化进入了一个新的发展阶段。时间分辨荧光免疫测定是20世纪80年代初期在免疫荧光分析的基础上发展建立的一种新型免疫分析技术。其原理和方法与一般免疫荧光法不同，所用示踪剂不是荧光素，而是采用镧系元素铕离子（Eu3+）或鋱离子（Tb3+）等的配合物标记抗体或抗原，并利用时间分辨荧光计测量法排除样品中非特异荧光的干扰，最大限度地提高了测定方法的灵敏度。,这种方法利用一种门控技术，使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光（图7.11）。它将FIA的灵敏度提高了几个数量级，可达10-17 mol L-1，明显提高了荧光免疫分析的特异性。,图7.11 时间分辨荧光测定 原理示意图,TrFIA法在灵敏度、特异性、稳定性及测量自动化程度等方面都可与放射免疫测定（RIA）相媲美，而其标准曲线范围宽（跨越45个数量级），最小检出值可达10-18 mol L-1，分析速度快，远远超过RIA、EM及发光免疫测定，并具有结合物制备较简便，有效使用期长，无放射性污染，应用范围广等优点。因此问世虽短，发展却十分迅速，成为目前超微量物质免疫分析最有发展前途的一项技术。,TrFIA的测定原理与通常的荧光免疫分析（FIA）基本相同，只是标记物和信号的测量不同。当Eu3+离子配合物标记抗原后，通过竞争反应，分离出免疫复合物，利用时间分辨荧光仪测定Eu3+离子发射的荧光强度，即可确定待测抗原的量。,在正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身的荧光信号较弱。加入酸性增强液后，稀土离子从免疫复合物中解离出来，与增强液中的二酮体、三辛基氧化膦或Triton X-100等重新形成一种微胶体化合物。其中的Eu3+在340 nm光激发下，可发出长寿命的高强荧光（613 nm）（图7.12），强度增加106倍，用时间分辨荧光仪记录下来进行分析检测。,图7.12 时间分辨荧光免疫分析原理示意图,7.3.6 化学发光免疫分析 酶免疫分析法克服了RIA中放射性污染的弊病，具有灵敏度高，设备简单，操作安全等优点，但也存在酶不稳定、光度测量范围窄等不足之处。随着免疫测定应用的日新月异以及分析方法及相关技术的发展，20世纪70年代末，Halmann和Velan建立了化学发光免疫分析（CLIA）。发光免疫分析是以发光物质为标记物，通过偶联反应，使标记物分子中的反应基团直接连接在标记免疫分子上。其检测原理与以上方法相类似。,化学发光免疫分析具有免疫反应的特异性，又兼有发光反应的高敏感性，因此满足了快速、简单、稳定、灵敏、特异和准确等要求。其最小检出限可达10-1210-15 mol。发光免疫分析以化学发光反应为基础。在常温下，一些特定的化学反应产生的能量使其产物或反应中间态分子激发，形成电子激发态分子；当其衰退至基态时，所释放出的化学能量以可见光的形式发射，这种现象称为化学发光（CL）。,能产生CL反应的物质称为化学发光剂或化学发光底物。化学发光试剂常用吖啶酯、鲁米诺及其衍生物，反应时发光剂发生高能化学反应，形成处于激发态的分子，当这些产物分子回到基态时，伴随着光子的释放发生化学发光现象。CL反应绝大多数属于氧化反应，因为该反应能提供足够的能量便其产物分子或反应中间态分子上升至电子激发态。目前应用在免疫测定中的重要化学发光反应有以下几类：,（1）氨基苯二酰肼类参加的CL反应：主要是鲁米诺（luminol）及异鲁米诺衍生物。它们在催化剂（如过氧化物酶，POD或HRP）的参与下被H2O2氧化而产生化学发光。发射光的波长为375550 nm，以425 nm波长为主。（2）吖啶酯参加的CL反应：这类化学发光剂不需要催化剂的参与，在过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。发射光的波长430 nm。（3）碱性磷酸酶（AP）参与的CL反应：化学发光剂为adamantyl l,2-二氧杂环丁烷芳基（dioxetane）磷酸酯，在碱性磷酸酶的作用下能分解成不稳定的dioxetane底物而发光。,（4）生物发光：常见的反应体系为虫荧素，在虫荧酶的催化下，有ATP，Mg2+及O2存在时，发生瞬时发光反应：LH2（虫荧素）ATP+Mg2 虫荧酶 LHAMP+LHAMP+O2 L（氯化虫荧素）CO2+AMP+h,dioxetane磷酸酯作为碱性磷酸酶的底物，是灵敏、稳定的发光剂。其连续稳定的发光，极广泛的线性范围，彻底改变了传统发光标记物不可避免的发光不稳定，在反应过程发生裂变，导致结果不稳定等缺陷，使化学发光由理想状态变为现实。传统的化学发光免疫分析技术常用聚苯乙烯作为固相载体，目前使用磁性微粒作为固相载体。微粒子磁性铁珠的粒径为7 m，用它为固相载体包被抗体或抗原，因其表面积大，测定中所需标本量极少，温育时间缩减，测定时间减少，且可降低交叉污染概率。,7.3.7 电化学发光免疫分析 在电极表面由电化学引发特异性化学发光反应，称为电化学发光（ECL）。将电化学发光与发光免疫分析结合起来就构成电化学发光免疫分析法（ECLIA）。它包括免疫反应、电化学反应和发光反应三个过程。电化学反应和发光反应同时进行，简称电化学发光反应。标记抗体或抗原所用的发光剂通常为三联吡啶钌（Ru(bpy)32+），它与电子供体三丙胺（TPA）在阳极表面同时各失去一个电子发生氧化反应，生成Ru(bpy)33+和TPA+*自由基。,Ru(bpy)32+-e Ru(bpy)33+TPA-e TPA+*TPA+*TPA*+H+Ru(bpy)33+TPA*TPA+Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+*Ru(bpy)32+h,Ru(bpy)33+是强氧化剂，TPA+*失去一个质子后变成强还原剂TPA*。TPA*在电极表面迅速还原Ru(bpy)33+生成激发态的三联吡啶钌Ru(bpy)32+*，其能力来源于Ru(bpy)33+和TPA*之间的高电化学电位差。激发态的三联吡啶钌Ru(bpy)32+*发射一个波长620 nm的光子,这一过程在电极表面可周而复始地进行，产生许多光子，使信号加强。,