总氮量的测定微量凯氏定氮法.docx

总氮量的测定微量凯氏定氮法实验一 蛋白质的定量分析 总氮量的测定微量凯氏定氮法 一、实验目的 1学习微量凯氏定氮法的原理； 2掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。 二、实验原理 天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分析测定主要是指蛋白质，核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，约在1516 %之间。因此只要测定蛋白氮，乘以6.25，即为粗蛋白质含量。 当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点，加入硫酸铜作为催化剂。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，从而计算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下： 本法适用范围为0.21.0 mg氮，相对误差小于±2%。 三、试剂和器材 试剂： 1浓硫酸 2粉末硫酸钾-硫酸铜混合物 330% NaOH溶液 40.010 mol/L盐酸 52 %硼酸 6混合指示剂：由50 ml 0.1%甲烯兰酒精溶液与200 ml 0.1%甲基红酒精溶液混合而成，酸色为紫红色，碱色为绿色 7蛋清液 器材： l改良式微量凯氏定氮仪 2消化炉 3消化管 4铁架台 5电子天平 650 ml容量瓶 7锥形瓶 8表面皿 9移液管 10量筒 11酸式滴定管 12酒精灯 四、实验步骤 1、消化样品 取2ml鸡蛋清样液，加入到消化管中，加入1.5g的催化剂，后在通风橱中进行操作。在消化管中加入放入浓硫酸6ml消化至消化管内的液体呈现出澄清的浅蓝色。去除消化管，将其冷却后定容到50mL容量瓶中。 2、清洗凯氏定氮仪装置 改良式凯氏定氮仪把蒸汽发生器、反应室和冷凝器几部分合为一体，使用前必须彻底洗涤。连接进水口与自来水管，打开水龙头。打开弹簧夹2，使水进入夹套至稍高于出水口，关闭弹簧夹2和3，用酒精灯加热使蒸汽通过进气口进入反应室进行洗涤，在冷凝管下口放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，冷凝管下端应完全浸没于液体中，洗涤12 min，观察锥形瓶中溶液是否变色，若基本不变色，证明蒸馏器已洗涤干净。将火移开，打开弹簧夹1，从加样漏斗加入少量蒸馏水，关闭弹簧夹1，由于夹套内温度降低使压力下降，可把反应室内液体通过进气口吸出到夹套内。如此重复数次清洗反应室，仪器即可使用。 图1.3 改良式凯氏定氮仪，1,2,3 弹簧夹，4 加样漏斗，5 进气口，6 反应室，7 夹套，8 冷凝管，9 出水口，10 进水口 3标准样品练习蒸馏操作 蒸馏样品和空白前，为了练习蒸馏和滴定操作，可用标准硫酸铵溶液做23次试验。取3个锥形瓶，各加5 ml硼酸及23滴混合指示剂，溶液应呈紫红色，用表面皿覆盖备用。加样前反应室内的液体应尽可能少，以免降低碱的浓度，延长反应时间，使蒸馏不彻底。 加样前先移去酒精灯，并打开弹簧夹2和3。打开弹簧夹1，用移液管吸1 ml标准硫酸铵溶液，把移液管头部插到加样漏斗颈部，将样品加入反应室。勿使样品加到漏斗上部，以免加碱后，氨挥发掉。取一只盛有硼酸-混合指示剂的锥形瓶，放于冷凝管下口，下口必须浸没在硼酸液面之下。然后用量筒从加样漏斗加入5 m1 40% 的NaOH溶液。在碱液未完全流尽时，关闭弹簧夹1，并在漏斗内加约2 ml蒸馏水，再打开弹簧夹1，使一半流入反应室，一半水留在漏斗内作水封。关闭弹簧夹2和3。 用酒精灯在夹套外加热。当锥形瓶内硼酸溶液吸收了氨气时，指示剂颜色由紫色变为绿色，自变色起计时，蒸馏35 min，移动锥形瓶使瓶内液面离冷凝管下口约1 cm，用少量蒸馏水洗涤冷凝管下口外壁，继续蒸馏约1 min，拿开锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。按以上操作再练习蒸馏两次后，三个锥形瓶一起滴定。 样品蒸馏完毕后，拿开锥形瓶及酒精灯，随即从加样漏斗中较快倒入一些蒸馏水，反应室内的废液即从进气口抽出，重复两次后，打开弹簧夹2和3，从夹套中排出废液。 4、加入5ml的消化稀释液。 5、用20ml的2%的硼酸封住蒸馏口。 6、进样20ml的40%的氢氧化钠，后加入少许水冲洗，水封住进样口。 7、酒精灯加热蒸馏瓶。 8、当第一滴氨水从冷凝管中滴下的时候，计时5min，后将硼酸溶液稍微离开蒸馏管口，让蒸馏管口在硼酸液面吹2min，清洗蒸馏管口。 9、用HCl滴定兰色蒸馏液和硼酸液的混合物，直至兰色褪去，稍微有一点粉色，滴定结束。 10、再重复59两次。 五、实验数据分析和处理 计算 C(V1-V2)´0.014´20´6.25´100% V式中：C标准盐酸溶液浓度，实验中是0.01094mol/L 总氮量= V1滴定样品用去的盐酸体积 V2滴定空白用去的盐酸体积 0.014氮的毫摩尔质量 V样品的用量，实验中是1.0mL 6.25蛋白质的转换系数 实验数据 V初 V末 (mL) V1(mL) 第一次滴定 0.10 6.55 6.45 第二次滴定 6.90 12.90 6.00 第三次滴定 14.10 19.90 5.80 (3)实验数据处理 V1的平均值是6.08mL，代入计算公式： 总氮量=11.60% 六、思考题 一】说明本实验中所用各种试剂的作用。 答： 1浓硫酸：氧化剂，分解蛋白质成氨气和其他成分。 2粉末硫酸钾-硫酸铜混合物：充当催化剂，硫酸钾可以提高消化液的沸点，硫酸铜作为催化反应的主要成分。 330% NaOH溶液：碱化消化液，使硫酸铵分解释放出氨气，用于后续的滴定颜色反应。 40.010 mol/L盐酸：滴定蒸馏液，定量分析。 52 %硼酸：吸收释放的氨气 6混合指示剂：由50 ml 0.1%甲烯兰酒精溶液与200 ml 0.1%甲基红酒精溶液混合而成，酸色为紫红色，碱色为绿色：指示滴定颜色反应。 二】分析凯氏定氮法测定样品蛋白质含量时误差的主要来源以及应注意的事项。 答： 凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源可能是样品、催化剂种类和用量、消化的时间、加碱液后的操作、蒸馏加热、清洗凯氏定氮仪的过程、凯氏定氮仪的气密性、氨气是否完全蒸馏出来；硼酸是否封住蒸馏管口、试剂的准确性、滴定终点的判断、滴定盐酸的浓度准确性等。 注意事项： 1、样品的取用量应适中，以免影响后续反应。 2、加入的催化剂硫酸钾和硫酸铜的配比适宜。 3、催化剂的添加量一定要准确，否则催化速度不一致，导致反应程度和挥发的氨不一样，误差大。 4、消化过程中，消化的时间应该充分，确保消化完全，消化至溶液呈现透明的浅蓝色。 5、消化后要将液体充分冷却，定容到容量瓶中备用。 6、消化之前检查凯氏定氮仪的气密性良好，后用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，要充分清洗。 7、消化过程中，加碱液后要迅速关闭进样口，防止反应放出的氨气逸出。 8、消化过程中，火焰的温度要适当，太小加热过慢，太大容易导致溶液暴沸甚至从进气口溢出。 9、消化过程中，用硼酸封住蒸馏管口，防止氨气逸出。 10、消化过程中，加热应保持均衡，冷凝水流速控制均衡，防止出现倒吸。 11、收集完氨气后，应用蒸馏水将蒸馏管口清洗，以收集在管壁残余的氨气。 12、滴定的时候，要控制滴定的速度由快到慢，准确判断滴定终点。 13、三次平行，保证收集的氨气的量应该相差差不多。