电泳基本理论课件.ppt

电泳基本理论,哈尔滨医科大学生物化学教研室,袁丽杰,内容摘要,1,概述,2,电泳的基本原理,3,电泳系统,4,支持介质,5,染料,6,影响因素,1,电泳概述,1.1,电泳的定义,带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方,向移动，这种现象称之为电泳,(electrophoresis,，简称,EP),。,电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不,同而对物质进行分离的一类实验技术。,带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的,速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度,和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度,除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的,带电性质及数目等因素有关。,1.2,电泳技术的发展过程,电泳现象早在,1808,年就已经被发现，但电泳作为一种分,离技术却是在,1937,年由瑞典科学家首先提出来的，并设计,出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模,式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界,面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、,1,、,2,、,和,球,蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，,1948,年他被授予诺贝尔奖。,20,世纪,50,年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、,醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。,60,年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如,聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。,1967,年在凝胶电泳的基础上建立了,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶,电泳技术。,70,年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘,电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳,、印迹转移电泳等技术。,90,年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来,科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，建立了各种,实验方法，电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸,收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所,需数据。,1.3,电泳的常用术语,(1),电泳迁移,(electrophoretic,migration),：,在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动,，单位是,cm,。,(2),迁移时间,(migration,time),：用,t,m,表示,在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动,所用的时间，单位是,min,。,(3),电泳速度,(electrophoretic,velocity),：用,V,ep,表示,在单位时间内，带电粒子在电场的作用下做定向运动,的距离，单位是,cm,/sec,。,(4),电场强度,(electric,field,strength),：用,E,表示,在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电,效应，单位是,V/cm,。,E=V/L,t,式中,V,为电压，,L,t,为两端电极的距离。,A,B,(5),电渗流,(electroosmotic,flow),：用,EOF,表示,在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷,之间相互作用，形成一个正离子层，导致流体朝负极方向,移动，称为电渗流，这种现象也称之为电渗,(electroosmosis),现象,如图。,电渗流迁移速度,(V,ep,),的表达式为：,?,电渗流迁移速度,V,ep,=,?,E,4,?,式中,?,为电解常数，,?,为支持物与表面平切面的,Zeta,电势,，,?,为缓冲液粘度，,E,为电场强度。,通常情况下，电渗流总是由正极向负极移动，只有在特,殊情况下如分离碱性蛋白质的阴极电泳时溶液,pH,较低，,固体支持物表面带正电荷，形成向正极移动的电渗流。电,渗流的大小受到,Zeta,电势，偶电层厚度和缓冲液粘度等因,素的影响，直观地看电渗流随着电解质浓度的增加而增加,，随着,pH,值的增加而加大。,(6),相对迁移率,(relative mobility),：用,m,R,表示蛋白,质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁,移率，即,蛋白质的迁移距离,(cm),m,R,=,示踪染料的迁移距离,(cm),2,电泳的基本原理,2.1,带电颗粒,溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电,质点而带电，在电场中就会发生迁移，移动方向取决于它,们的带电符号。,NaCl,Na,+,+,Cl,生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶,液中，它们的净电荷取决于溶液终的,H,+,浓度,2.2,电泳迁移率,(mobility),如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，,使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效,电荷,Q,和电位梯度,E,，即：,F,=,QE,(1),带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力,F,，对,于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从,Stock,定律：,F,=,6,r,v,(2),这里,v,是在介质粘度为,的溶液中，半径为,r,的带电颗粒,的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合,Stocks,定律。,F,还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大,小和介质的内渗等。,当带电颗粒达到稳态运动时，,F=F,，由,(1),、,(2),式推导,出：,v,Q,=,（,3,）,E,6,r,不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速,度用迁移率（或称泳动度）,m,来表示，定义为在电位梯度,E(V/cm),的影响下，颗粒在时间,t(s),中迁移距离,d(cm),，即,在单位电场强度,(1,V/cm),时的泳动速度：,v,d,m,=,=,(4),E,t,E,将,(3),代入,(4),，得到,Q,m,=,(5),6,r,由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒,所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数,，是该物质的物化特性常数。从,(4),式可以导出迁移率的,单位是,cm,2,s,-1,V,-1,。,2.3,带电颗粒的移动速度,v,与电位梯度,E,、电流密度,J,和导,电性,K,的关系,如果在同样实验条件下对某蛋白溶液做两个电泳试验，,一个试验用两倍的时间一倍的电压，另一个试验用一倍的,时间两倍的电压，从理论上讲，这两个试验中蛋白质的迁,移距离应该是相等的。但是实际上只能是大致相等，原因,是在电泳过程中还有其他因素的干扰，如在增加电压的同,时也增加了热效应。移动的速度决定于其分子的形状、相,对分子质量的大小、分子带电性质及数目，还与分离介质,的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。,我们把带电颗粒的移动速度用以下公式表示,v,=,m,E=,m,J/K,(6),由此可以看出，带电颗粒的移动速度,v,等于电位梯度,E,和,迁移率,m,的乘积，与电流密度,J,和迁移率,m,的乘积成正比,，与溶液的导电性,K,成反比。也就是说，电场强度越高电,泳速度越快；溶液的导电性越强，电泳速度越慢。因此电,泳速度随着电位梯度或溶液的导电性的变化而改变。,3,电泳的分类,3.1,按分离原理分类,(1),区带电泳,(zone,electrophoresis,，,ZEP),：是在半固相或,胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加,电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳,过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独,立的区带,(,图,3-2a),，这是当前应用最广泛的电泳技术。,(2),移界电泳,(moving,boundary,electrophoresis,，,MBEP),：,是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定,(,图,3-2b),。,(3),稳态电泳,(steady,state,electrophoresis),：带电颗粒在,电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，,电泳条带的宽度不随时间的变化而变化,，如等速电泳,(isotachophoresis,，,ITP),、,等,电,聚,焦,电,泳,(isoelectric,focusing,，,IEF)(,图,2c,、,2d),。,a,b,c,d,图,3-2,各种电泳分离原理示意图,a,区带电泳,b,移界电泳,c,等速电泳,d,等电聚焦,4,电泳系统,4.1,电泳仪及附属设备,从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后，近,50,年来,电泳仪器的发展迅猛，尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及,广泛应用，各种类型的凝胶电泳装置层出不穷，使电泳技,术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器,，种类很多。随着科学技术的不断发展，电泳仪器的分析,对象也越来越专门化，分辨率越来越高，操作越来越简单,，性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳,槽及附属设备三大类。,4.2,电泳仪：,根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：,(1),常压电泳仪,(600V),：用于净电荷和,SDS-,聚丙烯酰胺凝,胶电泳；,(2),高压电泳仪,(3000V),：用于载体两性电解质等电聚焦电,泳和,DNA,测序；,(3),超高压电泳仪,(30000-50000V),：用于毛细管电泳。,4.2,电泳槽：,根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳,槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。,(1),自由界面电泳槽,Tiselius,设计的自由界面电泳槽（图,3-3,）是一个,U,形玻璃,管，在,U,形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极,上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用,光学系统“纹影法,(schlieren)”,照相，得到电泳图谱。这种,电泳槽目前已不使用。,90,年代初发展起来的高效毛细管电,泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。,电极,电极,U,形管,3,Tiselius,自由界面电泳装置示意图,(2),管状电泳槽,50,年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个,电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可,插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内，凝胶在电,泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色,后呈圆盘状，因而称圆盘电泳,(disc,electrophoresis),。,圆盘电泳槽,(3),板状电泳槽,板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在,两,块,平,行,的,玻,璃,板,中,间,，,因,而,称,板,状,电,泳,(slab,electrophoresis),。板状电泳的最大优点是包括标准相对分,子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条,件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品,的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外,，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照,相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳,槽。,垂板电泳槽,转移电泳槽,平板电泳槽,双向电泳槽,制备电泳槽,4.3,附属设备,随着电泳技术的发展，电泳技术的种类逐渐增加，凝胶,电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方,面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如,梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、,凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。,5,电泳的操作模式,目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚,丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳，前者主要,用于蛋白质的分离鉴定，后者主要于核酸的分析,鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理,分类。,5.1,按电泳方式分类,(1),端电极电泳：有垂直式和水平式两种方式，多用于蛋,白质电泳。,(2),搭桥电泳：为水平式，水平板状电泳槽形式多样，凝,胶和缓冲液通过间接接触的方式，如用滤纸桥搭接，用缓,冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接（图,3-4,），后两者即半,干技术，多用于免疫电泳、等电聚焦。,A,B,C,图,4,水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式,A,滤纸桥,B,凝胶条,C,滤纸条,(3),潜水电泳：,为水平式，电泳时凝胶浸于缓冲液中，多用于核酸电泳。,5.2,按分离原理分类,(1),净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳；,(2)SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳；,(3),聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳；,(4),聚丙烯酰胺凝胶双向电泳；,(5),聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦；,(6),聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳；,(7),琼脂糖凝胶水平电泳；,(8),琼脂糖凝胶脉冲电泳；,(9),琼脂糖凝胶免疫电泳。,6,凝胶电泳的支持介质,6.1,支持介质的性质,采用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子,的对流和扩散，使被分离物质得到更有效的分离。支持介,质应当具备以下特性：,(1),物理化学性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影,响，保持原有的状态和性能。,(2),化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子,和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子,的电泳过程。,(3),分布均匀：内电渗小，结果重复性好,6.2,支持介质的分类,电泳的固体支持介质可以分为两类,:,(1),薄膜类：,薄膜类包括纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄,膜等,.,这类支持介质化学惰性好，在电泳过程中产生的,对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生,物大分子的电荷密度。,(2),凝胶类：凝胶类包括淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯,酰胺凝胶等。,这类介质相对薄膜类又了进一步，它具有高粘度和高摩,擦阻力，它在电泳过程中不仅能防止对流，减小扩散，还,具有凝胶的多孔性，孔径与蛋白质分子大小大致相同，因,而能产生分子筛效应,(molecular,sieving,effect),，其分离作,用既与电荷密度有关，又与分子大小有关，因而凝胶的分,离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小，对分离不同,相对分子质量的生物大分子极为有利。所以，生物大分子,如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质,量难以控制，操作繁琐，分辨率低，实验室中已很少使用，,现在用得最多的是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。,7,凝胶支持介质,7.1,聚丙烯酰胺凝胶,7.1.1,聚丙烯酰胺凝胶的特性,聚,丙,烯,酰,胺,凝,胶,(polyacrylamide,gel),是,由,单,体,(monomer),丙,烯,酰,胺,(acrylamide,，,简,称,Acr),和,交,联,剂,(crosslinker)N,N,-,甲,叉,双,丙,烯,酰,胺,(N,N,-methylenebi,sacrylamide,，简称,Bis),在催化剂和加速剂作用下聚合交联,而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称,为聚丙烯酰胺凝胶电泳,(polyacrylamide,gel,electrophorsis,，简称,PAGE),。聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质，与,其它凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点：,(1),孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，具有良好,的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量，通过,改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径，使大分子得,到较好的分离。,(2),在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好,(3),凝胶是由,C,C,C,C,结合的酰胺类多聚物，侧,链上具有不活泼的酰胺基，没有其它带电基团，所以凝胶,性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强。与生物大,分子不发生化学反应，电泳过程中不受温度、,pH,的变化,的影响。,(4),具有高分辨率和灵敏度，尤其是在不连续电泳系统中，,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，样品不易扩散。并有,多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度，分离蛋白质的,灵敏度可达,10,-6,g,。,(5),单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果具有很,好的重复性。,(6),凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样,品的制备，不致污染样品。,以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺,凝胶电泳、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度,凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术，不仅能分离,、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的,性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。,7.1.2,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式,聚,丙,烯,酰,胺,凝,胶,聚,合,机,理,是,通,过,提,供,氧,游,离,基,(free,radicals),的催化，使体系发生氧化还原作用,(catalyst-redox,systems),来,完,成,的,。,催,化,体,系,主,要,有,化,学,催,化,（,AP,TEMED,）和光化学催化（核黄素,TMTED,）体系。,(1)AP-TMTED,催化体系：属于化学聚合作用，,TMTED,是一种脂肪族叔胺，分子式为,H,3,C,/CH,3,N(CH,2,),2,N,H,3,C/CH,3,它的碱基可催化溶液中的,AP,使其形成游离氧自由基，,激活,Acr,单体形成单体长链，同时在交联剂,Bis,的作用下长,链彼此交联聚合成凝胶，反应式如下：,TEMED,催化,AP,生成硫酸自由基：,S,2,O,8,2,2SO,4,硫酸自由基的氧原子激活,Acr,单体并形成单体长链：,Bis,将单体长链间连成网状结构：,聚合反应受各种因素的影响，如系统中催化剂和加速剂,的浓度、,pH,、温度、分子氧和杂质都会影响凝胶的聚合,过程。,(2),核黄素,-TEMED,催化系统：属于光聚合作用，聚合原,理是核黄素在光照条件下分解，被还原成无色核黄素，后,者在有少量氧的条件下，被氧化形成自由基，从而引发聚,合反应。,7.1.3,凝胶总浓度及交联度与凝胶的性质：,(1),凝胶总浓度与凝胶特性：,凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚,丙烯酰胺凝胶特性，包括其机械性能、弹性、透明度、粘着,度及孔径大小的主要参数。,1962,年引入两个计算公式，即凝,胶总浓度（,T,）是表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含,量,a+b,T,=,100%,m,交联度（,C,）是表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总,量的百分含量。,b,C,=,100%,a+b,式中，,a,为丙烯酰胺单体的质量,(g),，,b,为交联剂,N,N,-,甲叉双丙,烯酰胺的质量,(g),，,m,为溶液的终体积,(ml),。,凝胶,a,、,b,的比例是很重要的，决定了凝胶的物理性状。,当,a:b,小于,10,时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；,当,a:b,大于,100,时，即使用,5%,的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；,通常用,a:b,在,30,左右，并且丙烯酰胺浓度高于,3%,，凝胶富有弹,性并且透明。,(1),凝胶总浓度及交联度对孔径的关系：,聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶的总浓度,T,和交联度,C,。,有效孔径随着,T,的增加而减小，电泳中带电颗粒移动时受到网孔的,阻力大，反之带电颗粒受到的阻力小。,当凝胶总浓度小于,2.5%,时，可以筛分相对分子质量为,10,6,以上的,大分子，但此时凝胶几乎是液体，通常要加,0.5%,的琼脂糖来增加凝,胶的硬度而不影响凝胶的孔径大小；,当凝胶浓度大于,30%,时，则可以筛分相对分子质量小于,2kD,的多,肽,在凝胶总浓度一定时，交联剂含量不同影响凝胶的孔径，交联剂,的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系见表,3-1,：,表,3-1 Bis,的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系,总凝胶浓度,(%),平均孔径,(?),Bis,占总凝胶的百分数,1,5,15,25,6.5,24,19,28,8.0,23,16,24,36,10.0,19,14,20,30,12.0,17,9,15.0,14,7,从表中可以看出，当,Bis,占总凝胶浓度,5%,时，凝胶的平均,孔径在各凝胶浓度时均最小，高于或低于,5%,时孔径相应变大。,凝胶孔径大小也受凝胶总浓度的影响，一般凝胶总浓度越,高，凝胶孔径越小。凝胶孔径大小有一定范围，每次制备凝,胶时所得到的有效孔径不完全相同。,(3),凝胶总浓度与凝胶的分子筛效应：,凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，在凝胶中生物大分,子的分离取决于它的净电荷和分子大小。分子筛效应的大小,取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小相接近的程度。凝胶,浓度不同，平均孔径也不同，不同大小和形状的大分子通过,孔径时所受的阻滞力也不同，加上大分子的电荷效应，使各,种大分子迁移率不同得以分离。,在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大,小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度,的分离，表,3-2,列出了蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关,系。大多数蛋白质在,7.5%,凝胶中能得到满意的结果，所以,这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用,标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。,表,3-2,蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系,蛋白质相对分子质量范围,(kD),适用的凝胶浓度（,T%,）,10,20,30,10,40,15,20,40,100,10,15,100,500,5,10,500,2,5,7.2,琼脂糖凝胶,7.2.1,琼脂糖凝胶的特性,琼,脂,糖,(agarose),是,从,琼,脂,中,精,制,出,来,的,胶,状,多,糖,(gel-,forming,polysaccharide),，琼脂又是从天然的红色的墨角藻,(red-seaweed),中提取出来的。琼脂含有两种多糖，即琼脂糖,和琼脂胶，从琼脂胶中脱去硫酸酯基和丙酮酸酯基就可获得,琼脂糖。琼脂糖的分子结构大部分是由,1,3,连接的,?,-D,吡喃半,乳糖和,1,4,连接的,3,6,脱水,?,-D,吡喃半乳糖交替而成。,(1),琼脂糖凝胶属于大孔胶，可以分析,10,7,的大分子，但电泳,分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫,固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小,取决于琼脂糖百分浓度，如表,3-3,；,表,3-3,琼脂糖凝胶的浓度与孔径的关系,琼脂糖,(%),孔径,(nm),0.075,800,0.16,500,1.0,150,2.0,20,(2),具有稳定的物理化学性质，对样品吸附极小，电泳图谱,清晰，分辨率高，重复性好；,(3),具有较高的机械强度，允许在,1%,或更低的浓度下使用,，且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用；,(4),琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂，制,备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回,收，达到样品制备的目的；,(5),琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程,序简单快速；,7.2.2,琼脂糖凝胶的主要性能指标：,(1),电内渗,(electroendosmosis,，简称,EEO),：是琼脂糖电泳中,由多糖骨架上的带电基团引起，主要是硫酸酯和丙酮酸盐，,这些阴离子基团被固定在介质中，相应的阳离子与其结合水,一起向阴极移动（图,3-6,），电内渗对,DNA,的分离没有显著影,响，但高电内渗时对大分子的迁移有一定阻碍作用，电泳耗,时较长。,(1),胶凝温度：将琼脂糖在溶液中加热至,90,溶解，然后,将温度下降至某一温度时由液态转变为固态，此温度即为,凝固点，称为胶凝温度。一般在,35,43,。,(3),熔化温度：将凝固的凝胶由固态转变为液态时的温度,即熔化点，称为熔化温度。一般在,75,90,。用于制备目,的时，采用低熔点琼脂糖，熔化温度需低于,30,，,(4),凝胶强度：定义为每平方厘米凝胶所能承受的重量,(g,/cm,2,),，凝胶强度与凝胶浓度成正比。凝胶强度越高，所能,允许使用的凝胶浓度越小。在电泳中通常使用,1%,的琼脂糖,凝胶。尿素和碘化钾等阻碍氢键形成的试剂也会降低凝胶,强度，使凝胶变软易碎，给操作带来困难。,(5),脱水收缩作用：是指琼脂糖凝胶中挤压出液体的现象,，使用时要用滤纸吸干凝胶表面的水。,7.2.3,琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用：,由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说，其分,子筛效应微不足道。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛,应用于核酸研究中，为,DNA,分子及其片段的相对分子质量测,定和,DNA,分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖对,DNA,的分离范围较广，用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为,200bp,至,50kb,的,DNA,。从表,3-4,中可以看到凝胶的浓度越低，,适用于分离越大的,DNA,。,表,3-4,不同琼脂糖凝胶浓度与分离,DNA,大小范围的关系,琼脂糖凝胶浓度,(%),线性,DNA,分子的有效分离范围,(kb),0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.4,6,1.5,0.2,4,2.0,0.1,3,7.3,新型凝胶介质,虽然聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是目前最常用的两种支持,介质，但是它们还存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝胶,聚焦的重复性较差，琼脂糖凝胶容易断裂等。近年来人们,正在寻求新型的电泳材料。,第一类：,N-,取代聚丙烯酰胺材料：,具有较强的水解稳定性，在较广的,pH,范围内稳定，能,在,pH2,13,环境中进行电泳，适合作为酸碱性,pH,范围等电,聚焦的支持介质；,具有高度的亲水性和大孔性，适合大相对分子质量物质,的分离；凝胶的机械强度高。,第二类：聚丙烯酰胺,琼脂糖混合物,(Polyacrylamide-,agarose,mixture),、聚丙烯酰胺,琼脂糖的衍生物混合物,(polyacrylamide-allylglycidyl,mixture),，这类电泳支持介质,具有以下优点：,具有聚丙烯酰胺分辨率高和琼脂糖大孔径的优点，机械,强度高，又具有良好的弹性，适合分离特大分子,(2500kD),，可用于病毒、,SDS,变性分子和高相对分子质量的脂蛋白,第三类：“电泳海绵”，是一些海绵状的支持介质材料,，还处于试验阶段，但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有,很多优点：,机械强度大，结构稳定，可以是亲水的也可是疏水的；,可以直接测量孔径，孔径范围在,nm,100,m,；,8,蛋白染染料,用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检,测最常用的方法。选择高吸光系数的染料，与生物大分子,紧密结合，形成有色不溶的复合物，而支持介质不吸附染,料，便于背景的脱色，有利于蛋白质条带的辨别和定量扫,描，从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。,可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多，常用的主要有,以下几种：,8.1,氨基黑类染色,：,蛋白质染色最早是用氨基黑类染料，是一类含有磺酸基,的酸性染料，它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合,盐。常用的有：,氨基黑,10B(amino,black,10B),萘黑,12B,200(naphthalene,black,12B,200),萘酚篮黑,6B(naphthol,6B),水牛黑,(buffalo,black),等。,这类染料对不同的蛋白质着色不同，有,蓝,色,棕,色,黑色，,借此可以鉴别不同类型的蛋白质。这类染料对不同的蛋,白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。,染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较,高的考马斯亮蓝所代替。,8.2,考马斯亮蓝,(coomassie,brilliant,blue,，简称,CBB),在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，,1965,年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵,敏度较高，可进行定量扫描。它可分为,R,和,G,型两类：,R,型为三苯基甲烷,(triphenylmethane),，每个分子含有两个,SO,3,H,基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合,形成染料,蛋白质复合物。,G,型为二甲花青亮蓝,(xylene,cyanine,brilliant,blue),，是一,种甲基取代的三苯基甲烷。考马,考马斯亮蓝,R-250,是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其,适用于,SDS,电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现,出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（,15,20,?,g,），,扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。,考马斯亮蓝,G-250,染色灵敏度不如,R-250,，其优点是在三氯,乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，,染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约,45,分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定量分析。,8.3,荧光染料：,是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记，于,电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法，但由于荧光标记,蛋白质的定量需要特殊的扫描装置，影响了此方法的广泛,应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种：,(1),磺酰氯,(2,5-,二甲氨基萘磺酰，,dansyl,chloride,，简称,DNS-,Cl),：是最早应用的荧光染料，它在碱性条件下与氨基酸、,肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，使它们获得荧光性质，,在,280nm,和,320nm,波长的紫外灯下可观察到电泳条带。,(2),荧光胺,(fluorescamine,，又称,fluram),：作用与丹磺酰氯,相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发,生反应，产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显,示荧光，标记的蛋白质是唯一的荧光物质，因此，凝胶没,有荧光背景。,(3)2-,甲氧基,-2,4-,二苯基,-3-,呋喃酮,2-methoxy-2,4-diphenyl-,3(2H)-furanone,，简称,MDPF,：其作用与丹磺酰氯和荧光胺,相似，其优点是凝胶上,MDPF,标记蛋白质的荧光可保持数月,。用,MDPF,标记时，荧光强度在蛋白质浓度,1,500ng,范围内,呈线性关系，标记蛋白做,SDS-PAGE,分析时，其相对分子质,量的对数,(log,10,),与相对迁移率之间呈线性关系。,(4)1-,苯胺基,-8-,萘磺酸,(1-amino-naphthal-sulfonic,acid,，简,称,ANS),：染料本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下,可显出黄绿色荧光。电泳后将凝胶置于此染料溶液中，,1,3,分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。,8.4,硝酸银染色：,目前染色机理尚不清楚，可能是将结合在蛋白质上的银离,子还原成金属银而显色，研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基,酸在银染中的重要性，染色灵敏度是考马斯亮蓝,R-250,的,100,倍左右，可以检测,0.38ng,/mm,2,的牛血清白蛋白。银染显色的,方法大致可以分化学显色和光显色两类。,(1),化学显色法,(chemical,development),：,又分为双胺银染法,(diamine,silver,stains),和非双胺银染法,(non-diamine,silver,stains),。,双胺法：是用碱性的,NH,4,OH,形成银,双胺复合物，固定后,的凝胶浸泡在此溶液中，通过酸化（通常用柠檬酸）显像，,使用较广泛。,非双胺法：是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中，银,离子与蛋白质发生作用，在碱性条件下，用甲醛将银离子还,原为金属银而显像，用酸性溶液（柠檬酸或醋酸）终止显色,反应，用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双,胺法的灵敏度较双胺法高,10,倍。,(2),光显色,(photo,development),：,显色反应是固定后的凝胶在酸性环境中用光能将,银离子还原成金属银而使蛋白条带显色，它的优点,是操作程序简单，使用一种染色溶液即可达到显色,目的。,8.5,特殊蛋白质染色,:,(1),糖蛋白染色：糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的,染,色,来,检,测,。,如,与,糖,链,的,反,应,，,用,过,碘,酸,-Schiff,试,剂,(periodic-,Schiffs,reagent),染色，简称,PAS,染色，显色结果在,543nm,处可观测到颜色。检测灵敏度，最高可以达到,40,ng,糖蛋白。,(2),脂蛋白染色：脂蛋白可以用常规的染色方法，苏丹黑,B(sudan,black),是常用的染料，银染法仍然是最灵敏的方法,。近年有报道一种双染色方法，先用一种发荧光的染料,Filipin,使脂蛋白染色，再用考马斯亮蓝使其它蛋白染色，这,样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其它蛋白，灵,敏度高，可检测低至,20,ng,低密度脂蛋白。,(3),铁蛋白染色：血红蛋白、转铁蛋白和其它含铁蛋白能用,多种方法检测，如普鲁士蓝,(prussian,blue),显色，它与蛋白质,分子中的铁离子结合，方法十分简便。,(4),铜蛋白染色：可用茜素蓝,S(alizalin,S),显色，它与蛋白质,分子中的铜离子结合，蛋白条带为蓝色。,8.6,酶活性染色,蛋白质经过电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳后可以保持生物活性,，包括酶活性，这就给同工酶的检测创造了条件。,8.7,免疫学染色,免疫学方法是一种简单而且专一性的检测方法。将辣根过,氧化物酶或放射性同位素标记的抗体用于免疫检测，经过酶,与底物的显色反应，使与抗体免疫结合的蛋白条带清晰地显,现出来。现在最常用的方法是凝胶电泳后通过电泳印迹将蛋,白转移到固定化膜上，然后利用相应的抗体进行免疫检测。,染色,核酸：,*,多用,EB,（菲啶溴红,2.3,二氨基，,5,乙基，,6,苯基菲啶溴盐）,:,可在,0.5g/ml,浸胶,30,分钟或,直接将,EB,加在胶中,紫外照射产生橙色荧光,照,相,?,丫啶橙：能区别单双链,DNA,或,RNA,?,sS-DNA(RNA):,红色荧光,?,dS-DNA:,绿色荧光,?,*,放射自显影：,32P,标记。,?,蛋白：氨基黑,10B,、考马斯亮蓝,R-250,、考马,?,斯亮蓝,G-250,、银染,?,固定,染色,洗脱,干胶。,?,凝胶上样品的回收：,?,*,低熔点琼脂糖法（,LM,）,62-65,熔解胶,?,DNA,不变性,?,*,玻璃纤维过滤法：加,KI,、,NaClO4,、柠檬,?,酸钠，在一定温度下将胶熔解,玻璃纤维,?,过滤,超离心将胶与,DNA,分开。,9,影响电泳的环境因素,在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷,的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度,、解离趋势、两性行为等影响外，还与其它外界环境因素,有关。,9.1,电场强度的影响：电场强度是指电场中每厘米的电位,降，也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起,着重要作用，电场强度高，带电颗粒泳动速度快，电场强,度低，带电颗粒泳动速度慢。,9.2,溶液,pH,值的影响：大部分生物大分子都具有阳离子和阴,离子基团，这些基团的解离常数不同，溶液的,pH,值决定被,分离物质带电基团的解离程度，所以生物大分子的净电荷,取决于环境的,pH,值。,pH,影响着生物大分子的电泳迁移率，,溶液的,pH,值距离蛋白质的等电点,pI,越远，蛋白质带电性越,强，泳动速度越快；,pH,值距离蛋白质的,pI,越近，蛋白质带,电性越弱，泳动速度越慢。电泳时为保持,pH,恒定，必须采,用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时，要选择合适,pH,的缓冲液，使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较,大差异，有利于彼此分开。,9.3,溶液离子强度的影响：溶液中的离子强度直接影响被,分离物质的电动电势,(,?,),。带电颗粒的迁移率与离子强度的平,方根成反比。如果溶液的离子强度越大，电动电势越小，泳,动速度越慢；如果溶液的离子强度越小，电动电势越大，泳,动速度越快。高离子强度时电泳条带较细窄。一般最适合的,离子强度在,0.02,0.2,之间。溶液离子强度的计算公式如下：,I=1/2,s,cz,2,式中，,I,为离子强度，,s,表示溶液中有,s,种离子，,c,为离子的,摩尔浓度,(mol,/L),，,z,为离子价数。溶液中离子种类多，浓度,大，离子价数高，则离子强度大。,(1,9.4,电渗的影响：固体支持物表面的电荷使支持物附近溶,液分子形成偶电层，溶液在电场中向一定方向移动，即电渗,现象，溶液移动的同时携带颗粒一起移动。,9.5,温度的影响：在凝胶电泳过程中要产生焦尔热，而热对,电泳的分离效果影响很大。温度升高时，介质粘度下降，分,子运动加剧，使自由扩散的速度变快，迁移率增加。,9.6,介质的影响：介质的交联度直接影响分离效果，介质的,纯度影响聚胶效果，介质的非特异性吸附会增大电渗。,3.2.2.6,应用,分离纯化样品,测定分子量,组建物理图谱,鉴定重组体,分子杂交,测序,PCR,检测,分子标记检测,琼脂糖凝胶电泳步骤：,1.,缓冲液的制备：,?,常用,TAE,或,TBE,，,PH,值在,6,