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实验一 组织制片技术实验一 组织制片技术 显微鉴定法就是利用显微镜、显微技术及显微化学方法等对中药进行分析鉴定的方法。可以确定中药的真伪、纯度、品质以及建立鉴别标准。目前多数用于品种鉴定，部分用于定量分析。在鉴定过程中，以采用显微镜观察动、植物的组织构造、细胞形状、内含物的特征以及矿物的光学特性等为主要内容。按照鉴定的方法可分为组织鉴定、粉末鉴定、显微常数测定和显微定量等。组织鉴定是粉末鉴定的基础，以粉末鉴定应用最为广泛。 显微鉴定是一项专门技术，需要有植物(动物)解剖学、矿物学的晶体光学、植物显微化学等基本知识，并掌握显微制片、显微观察和描述、显微摄影和绘图、显微测量等基本技术。显微鉴定的主要仪器有各类光学显微镜和电子显微镜等，通常使用光学显微镜。 1.掌握显微制片方法 2.掌握显微测量的方法和放大倍数的使用 3.掌握显微特征的观察与描述方法和显微绘图技术 4.熟悉掌握显微测定尺的使用方法 5.了解显微摄影技术与方法 1.仪器 生物显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，显微描绘器，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，酒精灯，单面刀片，粉碎机，绘图板，铅笔等。 2.试剂 水合氯醛试剂，苏丹试液，稀甘油试剂，盐酸，硝酸，碘化铋钾试剂，氯化锌碘试液，硫酸，-萘酚浓硫酸试液，碘试液，间苯三酚试液，钌红试液，硝酸汞试液，乙醚，石油醚，90%乙醇，70%乙醇，-萘酚乙醇溶液，稀盐酸，稀醋酸等。 3.药材样品：牛膝、薄荷 4.药材粉末：大黄、肉桂、山药 一、显微鉴定 1.组织鉴定 组织鉴定是通过观察中药的组织构造特征来达到鉴定目的，主要用于个体较小的完整药材鉴别。通常用以鉴别药材性状特征不明显或外形相似而组织构造不同的类似品、混淆品、代用品、伪品，或用于多来源药材的对比鉴别，也可用于确定某种化学成分的存在部位，以考查质量。一般地说，组织鉴定对不同科属来源的药材鉴别比较容易，对于相同科属来源的药材鉴别比较困难。 2.粉末鉴定 主要是通过观察中药的细胞、内含物和颗粒物质的性状特征及性质来达到鉴定的目的。通常用于粉末药材、外形较大或组织构造无鉴别特征的药材、破碎药材、粉末性的中成药。 3.显微常数测定 常见的显微常数主要有用于植物的叶类中药鉴别的栅表细胞比、气孔数、气孔指数、脉岛数和脉端数等，这些显微数据常因中药原植物种类不同而异，常用于叶类药材、部分花类和带叶的全草类药材的定性鉴别。尤其是一些同属不同种来源的药材，当其他显微特征如毛茸、结晶等比较相似而难以鉴别时，这些显微数据的测定对于品种鉴定具有重要的意义。 4.显微化学鉴定 在进行显微鉴定工作中，经常用显微化学反应来检查中药细胞壁和细胞内含物化学物质的性质来达到鉴定的目的。当药材的数量很少、其中的某些成分化学反应较灵敏时，可使用显微化学鉴定法。 二、显微标本片的制备 在进行显微鉴定时，应首先选择具有代表性的检品，制作显微标本片，然后在显微镜下进行观察。显微标本片根据制作方法和保存的需要，分为半永久制片、永久制片和临时制片3大类。 半永久制片的封藏介质是半固体，可作暂时性保存；永久制片的封藏介质是固体，可作长期保存，但其制作费时，多用于特殊目的，如供显微摄影和核对标本等应用；临时制片的封藏介质是流动性液体，容易损坏，不耐久藏，但制作简单、迅速，适用于一般观察及进行显微化学反应，在中药鉴定工作中应用最多。 在鉴定工作中，由于观察的目的不同，对不同检品采取的制片方法也不同，所以又分切片标本片(包括横切片、纵切片；纵切片又包括切向纵切片和径向纵切片)、解离组织标本片、表面标本片、粉末标本片和磨片等。其中横切片多用于观察组织的排列特征；纵切片多用于观察茎、木类中药的某些细胞组织，如射线的特征；解离组织片用于观察某些细胞的形状，如纤维、石细胞等；表面片多用于观察叶、花、全草、果实和种子等的表面特征，一般取某一部分制片；粉末片多用于观察组织碎片、细胞及后含物或某些中药颗粒的特征；磨片用于坚硬药材如骨类、贝壳类及矿石的显微特征观察。 根据鉴定工作的需要，可采用徒手制片和机械制片等手段，制备各种显微制片供显微特征的观察和描述。 1徒手切片制片法 取材 根类，一般取主根中部，长23cm，直径11.5cm，较粗的根或根茎可用分割法，用刀割取所需部分；叶类以及鳞茎和完整的鳞叶，一般取主脉中部带有少量两侧叶肉部分；花类，一般取各部分分别制片；果实种子类，较小型的取完整者，大型果实也可用分割法取所需部位。 所取样品均需有代表性，应无畸形、虫蛀、霉变或其他污染等。 软化 选好样品后，新鲜或软硬适中者可直接切片，干燥材料应经软化处理后再进行切片，常用的软化方法有以下几种： 冷水或温水浸泡：适用于一般样品。 低浓度乙醇浸泡：适用于含黏液质和菊糖等水溶性物质的样品。 水煮法：适用于木材等坚硬的样品。方法是将干燥样品投入冷水中煮沸至沉入水底，即示细胞内空气已被除尽，取出样品，放入甘油乙醇的软化液中软化，至软硬适中。 水蒸气软化法：适用于作显微化学用的样品。 方法：是把样品放干燥器隔板上，再放入含5苯酚的水适量，旋紧干燥器，一般经12-24小时，即可吸湿软化，或在干燥器中放温水不超过隔板，隔板上铺湿纱布一层，放上干燥样品，加盖密封，45恒温，至样品软硬适中。 徒手切片 按常规法：右手持徒手切片，则以左手姆指和食指夹持软化好的样品材料，用中指托着，使材料略高出食指和拇指，左手肘关节靠桌沿，以免切片时晃动，右手执切片刀片，与材料的切面保持平行(刀片或材料用蒸馏水或选择的润湿剂润滑，更便于切)，刀口向内，从左至右移动，一次切下，所得薄片约在1020m之内。材料和刀刃经常润湿反复切削，将切削的薄片用毛笔沾水(或经选择的润湿剂，如稀甘油等)轻轻顺刀口方向拂下，放入盛有润湿剂的培养皿中，再选择薄而完整的切片标本，用稀甘油等封藏观察，必要时还应作水合氯醛液透化加热，稀甘油封片观察。 对较小的材料或叶片，可用小通草、胡萝卜及质厚的叶片等作夹持材料，即将小通草等夹持材料纵剖一条缝，把材料放下夹上，注意材料要放正，使切削时与刀片成一平行面。切削时连同小通草等夹持材料一起切下，放入盛有润湿剂的培养皿中，选择时除去夹持材料，按一般制片法及特殊处理制片即得。 制片 选取透明完整的切片，根据不同鉴别目的选用适宜的试剂装片。一般蒸馏水等直接装片法，在药用植物学已做介绍。下面重点介绍水合氯醛加热透化装片法： 取合格切片置洁净的载玻片上，加23滴水合氯醛试液，解剖针混匀，于酒精灯的小火焰上微热至沸，移下，略冷，补加一滴试剂，再加热至当沸，如此反复至切片透明止。一般需要2-3次即透化完全。加稀甘油至适量混匀，将切片摆在玻片中央略偏一方的位置，小心加上盖玻片，用吸水纸吸去多余的试液至试液充满整个盖玻片且不游动为止，擦净玻片边缘及反面的污物，即可镜检。徒手切片经水合氯醛透化后，脱水染色，也能制成永久片。 2.粉末制片法 粉末的制备 选取鉴定准确，具有代表性的药材，用小木锉锉下少许粉末或经粉碎过5080目筛。 粉末制片法 粉末的临时制片一般应用时做三种不同的装片，即水装片、稀甘油或甘油醋酸装片、水合氯醛试液装片。用牙签挑取少许药材粉末，放置玻片中央稍偏一侧的位置，根据需要加适当试剂12滴，用解剖针轻轻搅匀，小心加盖片即可。水合氯醛加热透化的标本片，一般应加热23次，注意点与徒手切片制片法相同。在制片过程中，应摸索粉末和试剂的适宜用量，又快又好的做出合格的粉末临时标本片。粉末药材也可用甘油明胶做成半永久片，经脱水染色透明后做成永久标本片。 3表面制片法 本法适用于叶片、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等。另外浆果、草质茎和某些地下茎的表皮也可制成表面装片。 整体封藏法 适用于很薄的叶片、萼片和花瓣等样品，可剪取所需部位2小片，2约4mm，一反一正放载玻片上。加水合氯醛试液加热透化完全，盖上盖玻片即可。也可放试管中加水合氯醛试液加热至样品透明，再取样装片。孢子、花粉粒、雄蕊或雌蕊等，可直接装片。 表面撕离法 较厚的叶片、萼片、花瓣及浆果、茎等，可用镊子将软化好材料的表皮轻轻撕下，将面朝上，放载玻片上，加水合氯醛透化至透明，盖上盖玻片即可。 4组织解离制片法 利用化学物质将植物细胞与细胞之间的中间层物质溶解，使细胞相互分离的方法。称为组织解离。解离前，将样品切成宽或厚约2mm的小条或小块。常用的组织解离法有以下几种： 氢氧化钾法 适用于薄壁组织发达，木化组织少或散在的样品。 置样品于试管或小烧杯中，加5氢氧化钾溶液适量，加热至用玻璃棒轻压能离散为止。倾去碱液，加水洗至中性。取所需部位，置载玻片上，用解剖针撕开，稀甘油装片镜检。 硝铬酸法 适用于坚硬的样品，木化组织发达或集成较大群束。 置样品于试管或小烧杯中，加硝铬酸试液适量，放置，至用玻璃棒轻压能离散为止。也可稍加热，缩短解离时间。倾去酸液，加水洗至中性，照1法装片。 氯酸钾法 适用范围同2。置样品于试管中，加硝酸溶液及氯酸钾少量，缓缓加热，待产生的气泡渐少时，再及时加入氯酸钾少量，以维持气泡稳定产生，至用玻璃棒轻压及离散为止，倾去酸液，加水洗至中性，照法装片。 用氯酸钾法解离操作时应在通风处，以免中毒。 三、显微观察与描述 1显微观察的方法 在显微镜下镜检时视野的寻找应先用低倍镜，再用适当的高倍镜观察。即按“先低倍后高倍”的原则进行。为了避免在显微观察时，对标本片内某些少见或偶见的特征遗漏而影响观察结果。我们可采用“之”字移动法，使标本片沿着一定的线路移动，这样可以检查到玻片下的各个部位。 此法是在对焦后，旋动移动器，从盖玻片的左上角开始，逐渐使视野由左向右移动，到达右端后，使视野向近侧移动2334个视野，然后使视野由右向左移动，到达左端后，再如前法移动，直到整个标本片全部观察完毕。镜检时视野移动线路如图13。 图13镜检时视野移动线路图 在进行一般的鉴定工作中，为了防止粉末混合不均匀的因素，需观察13张标本片为宜，以消除取样引起的差异。 2鉴别特征的重复观察 在观察显微标本片(尤其是粉末或解离组织片时)，往往需要重新观察某个显微特征颗粒，为此有必要对该特征在标本片中的位置进行记录，以便再次观察时能够迅速重现。记录的方法有如下两种： 坐标法 把需要重现的特征移至视野的中央，记录标本移动器上横坐标，与纵坐标的位置即可。在重复观察时，只要放上该标本片并把标本移冬器的纵坐标调节到记录的位置。所需观察的目的物就会出现在视野中。 标记法 纸上标记法 即剪一小片白纸，其形状与盖玻片相同，在纸上用小圆圈标记出盖玻片下目的物出现的相应位置，然后贴在载玻片的一侧，以供参考。盖玻片标记法 即用标记笔在盖玻片上标记目的物的位置。应当注意的是，无论采用哪种记录方法，盖玻片都不可移动。否则记录的数据或位置可能失效。 3显微特征的描述 中药的显微特征是通过观察其各种显微制片所得到的显微形象，对这些显微形象进行准确而明白的描述是十分重要的。因此，显微特征的描述是显微鉴定工作中的重要内容，也是必备的基本功之一。 (1)显微特征描述的一般方法 组织排列的描述 主要用于完整药材的各种制片的组织观察。在描述时，一般是由外向内依次进行。例如茎类中药中草质茎的组织排列，应该先描述表皮，然后依次描述皮层、中柱鞘、维管束(韧皮部、形成层、木质部)、射线与髓。在描述中除按常规要求注意其各部分的位置、形态、有无其他组织分布等特征外，还应该主要注意以下几个方面的问题： 射线：一般由几列细胞组成，单凭横切面观察，有时可得出错误的结论，要得到正确的结论，必须通过切向纵切面的观察。在切向纵切面上，可以见到多列式射线往往呈双凸透镜形，中间有多列细胞而上下两端渐窄至仅有一列细胞。因此，在横切面上由于切的部位不同，可以见到射线有一至多列细胞组成。 形成层：真正的形成层只有一层扁平的薄壁细胞，但与刚分裂形产生的上下几层细胞没有明显的区别，在描述时有人把形成层描写为由数层细胞组成，这是不正确的。实际上，把这几层形状相似的细胞带称为“形成层区域”比较恰当。 此外，双子叶植物根类具有次生构造，如果表面具有周皮覆盖，则通常不会有皮层存在，因为根的周皮通常发生于中柱鞘部位，等到周皮出现在根的表面时，皮层早已被推出而死亡并脱落了。在这种根的木栓层内侧有时可见到类似皮层的组织，这层组织很可能是栓内层，应当通过周皮发生部位的研究来加以确证。 细胞形状的描述 可采用平面和立体两种方式进行，具体运用哪种方式进行描述，可根据具体情况和工作需要加以选择。 平面描述：就是根据一种显微制片上见到的细胞形状进行描述；立体描述：就是把显微制片上见到细胞三个切面(横切、径向纵切、切向纵切)的形状综合起来，描述其立体形状。平面描述比较简单易行，但不易使人得到立体的概念；而立体描述需要综合后才能写出，但其概念明确，最适用于粉末药材的观察。例如木拴细胞的平面描述：横切面观扁平而切向延长，纵切面观扁平而径向延长，表面观呈多角形；立体描述则是把上述三个切面见到的形状综合起来，描述其立体形状，即木栓细胞呈扁平多边形。又如纤维，平面描述其横切面观为多角形或小三角形，纵切面观为窄长纺锤形，纵向延长。横切面其中部呈多边形，末端呈三角形。 大小和数量的描述 有三种方式可在不同的情况下采用。 a.当目的物的大小或数量差异很小时，可记载一个数字，如直径约30m。b.当目的物的大小或数量差异不大时，可记载两个数字，即最小值与最大值，如长为1540m，如有少数达50m，则可描述为，长1540(50) m 。c.若目的物的大小或数量有很大差距时，可记载三个数字，即最小值、常见值(不是平均值)和最大值，如长204080m。 在大小和数量的描述上，允许有少量超出上下限范围的数值，但超出的数字一般不得过±10。 四、显微测量 使用标定的显微量尺，在显微镜下测量显微目的物的大小，称为显微测量。显微量尺是显微测量标尺的简称，是用来测量显微镜下所观察物体的大小和数目的测量工具。显微量尺由镜台量尺和目镜量尺两部分组成，以m为长度单位。 1.镜台量尺,又称镜台测微计，是一种刻有标尺的特制载玻片。标尺全长1mm，刻度精确，共刻有10个大格，每一大格又分成10格小格，所以共有100个小格，每一小格的长度是0.01mm，即10m。有的标尺全长2mm，分为200个小格。标尺的外围有一黑环，便于找到标尺的位置。标尺上用树胶封固一圆形盖玻片加以保护。 镜台量尺是显微测量的标准，用于校正目镜量尺，并不直接用于测量物体。 2.目镜量尺，又称目镜测微计，是一种放置在目镜筒内的标尺，为直径1820mm的圆形玻璃片，其上刻有各种形式的标尺，有直线式和网格式等。测量长度的标尺为直线式，在圆形玻璃的中央，划有精确的平行刻度线，全长1cm或5mm，等分成100个小格或50个小格。测量面积或计算数目的为网格式测微计。 使用时，将目镜从镜筒中取出，旋出接目透镜，将目镜量尺放在目镜的光阑上，使有刻度的一面向下，再将接目透镜复位旋上，插回镜筒中，即可进行测量。 目镜量尺是用于直接测量物体的，单每小格的长度未知，因此必须用镜台量尺来校正，确定目镜量尺在不同条件下，每一小格的实际长度。 3.目镜量尺的校正 把目镜量尺装入目镜筒内后，将镜台量尺安放在载物台上，象通常观察标本一样，把有标尺的部位移到视野中央，调整焦距，看清楚标尺上的刻度线；转动目镜，使镜台量尺和目镜量尺相互平行；适当移动镜台量尺，使两量尺一端的刻度线相互重迭在一起，再找出两量尺在另一端的重迭刻度线，分别记下两个量尺在两条重迭线之间的小格数，按下列公式计算： 镜台量尺的格数×10m 目镜量尺每1小格的实际长度= 目镜量尺的格数 例1：目镜10×，物镜10×，测得镜台量尺58小格与目镜量尺40小格完全重迭。则： 58×10 目镜量尺每1小格的实际长度 14.5m 40 例2：目镜10×，物镜10×，测得镜台量尺21小格与目镜量尺60小格完全重迭。则： 21×10 目镜量尺每1小格长度 3.5m 60 为了测量准确，一般需要重复测量35次，取平均值，小数点后面保留一位数。测得的数据，只要不更换显微镜或镜头，就能长期使用，一般记录在卡片上，以便查用。 4.微细物体的测量 取下镜台量尺，换上欲测标本片，观察，用目镜量尺测量物体所占的小格数，乘以目镜量尺每一小格的已测好的实际长度，即得。 例如：在10×40镜下测得山药针晶束长40小格，每一小格长度为3.5m，针晶束长度是： 3.5×40140m 由于观察得误差，如果计算结果有小数，可四舍五入。 5.使用显微量尺得注意事项 显微量尺的校正和使用操作是，必须先低倍镜，再高倍镜。 两个量尺重迭线之间的小格数应尽量多一些，因数目越少，误差越大。 更换显微镜或镜头后，必须重新校正和换算目镜量尺每小格长度。 物体测量通常使用高倍镜，测量长形物体如毛茸、纤维等，也可用低倍镜。 五、显微绘图 1.显微描绘器的使用 显微描绘器是用于描绘在显微镜下扩大的物象时所用的一种仪器。显微描绘器利用两组光学系统将显微镜中的物象和图画的铅笔象相迭合，同时送到观察者的眼中，以利准确地依影描绘。 显微描绘器种类很多，下面介绍无柄描绘器： 构造和原理 描绘器是由两个三棱镜A、B粘合在一起，A棱镜地粘合面PP上，除中央部位的小圆孔M外，均涂以水银；旁侧有一反射棱镜C，与垂直方向成75°角，其底面FF上亦涂以水银。D为接目镜，E为接物镜。观察时，载玻片上物体的物象经接物镜E，接目镜D，并通过两个三棱镜粘合面PP的中央小孔M而达于眼，同时绘图板G上的铅笔H，也经C棱镜底面FF反射至PP平面而达于眼。这样，眼睛能同时看到显微镜下的物体和绘图板上的铅笔，进行描绘。 使用方法 将显微镜正放于绘图板的左方，按常规放置标本片，调节，使物象清晰。 取下接目镜，在镜筒上端装上描绘器的附着器，放回接目镜，再套上描绘器。 将绘图纸固定在绘图板上，调节绘图板的倾斜度，使与描绘器的角度相一致，再调节光线，使视野中的物象与铅笔象均清晰，就可进行描绘。 描图像的放大倍数计算和调整常见的两种方法 把镜台量尺的刻度线通过描绘器描绘在图纸上，用量尺测量绘出的两刻度线之间的长度，除以镜台量尺两刻度线之间的实际长度，即得图像的放大倍数。 如：图纸上两刻度线之间的长度为10mm，而镜台量尺该刻度线间的实际长度为0.1mm，放大倍数10÷0.1100 也可直接用绘出得标尺表示放大倍数。 用目镜量尺测得物体的长度或大小，除绘图纸上物象在同一方向测得得长度、大小，即得图像放大倍数。 如：大黄簇晶在图纸上绘得直径为24mm，而在显微镜下得实际长度为120m，放大倍数24÷0.12200 放大倍数的调整，一般可利用伸缩显微镜镜筒或调整绘图纸的高低，使放大倍数成为整齐数字，调整合适，保持显微镜、描绘器、绘图纸的位置不变，即可描绘。 注意：描绘图像的放大倍数是借助显微量尺和直尺计算而得，切不可将显微镜本身的放大倍数误认为是物象的放大倍数。 描绘方法 先描出目的物的图像轮廓，再描绘明显的特征，如较大的纹孔、较粗的层纹等。当描绘一个视野容纳不下的大形或长形物象时，可以先描绘一个视野，然后微微移动标本片，再描绘连续的部分，须注意，移动前，要确定23个明显的标志，以免移动后物象与图像衔接不上。移动标本片和图纸要平行进行，每次移动距离不应超过2/3个视野。描出草图后，卸除描绘器，再仔细观察目的物，并与图像核对，作进一步的加工修整和补充必要的细节，成为铅笔图。然后可根据需要再用硫酸纸依样描绘成墨线图。 2.药材组织简图绘制法 采用一定的图案符号，来表示药材切面中各种组织即某些特殊构造的层次和分布范围，这种组织图，称之组织简图。绘制方法如下： 制作标本片 制作反差较大的标本片，如各种二重、三重染色的石蜡切片，经间苯三酚-浓盐酸、氯化锌碘液或其他试剂染色后的手切片，要求组织结构清晰，界限分明。 观察 描绘前，需要仔细观察标本片，熟悉切片中各种组织的构造层次，重要鉴别特征的位置、各种组织所占的比例等。 勾画轮廓图 用幻灯机或投影仪，将标本片投像于绘图纸上，调整合适的放大倍数，用3H铅笔轻轻勾画出各个部位的轮廓，不清晰的部位在显微镜下，用显微测量加以校正。小型材料，可以直接用描绘器进行勾画。徒手勾画法。 修正铅笔图 用HB型铅笔修正上述轮廓图，将各部位即重要特征，分别用规定的简图符号细心地描绘成铅笔图。 图注及图名 简图绘完后，用整齐的引线将各部位依次向右方或上、下方引出，写上图注，图下方写上图的名称并注明放大倍数。 注意事项 绘简图符号时，应注意线条的平直和圆顺，点应均匀圆正，色调一致。简图是平面图，不应绘出立体感，所有部位均用符号表示，不应把某个部位绘成详图。简图一般要求整体性和全面性，但有的药材也可只绘局部或主要部位。 3药材组织详图绘制法 组织详图是把组织中各种细胞，由外向内一次绘出的组织图。绘制方法如下： 、项同组织简图绘制法。 勾画轮廓图 利用描绘器观察绘图，或显微照相后依次放大的照片绘图。先用3H铅笔绘出草图。直径较小的组织可全部绘出，直径大的组织可由外向内分成数段，选取最有鉴别意义的组织特征描绘。描绘时，各段及各部位细胞的放大倍数应一致，各种细胞及内含物等应依次准确绘出，切忌随意填充。 详图中各类细胞的表示法及各种类型铅笔的使用： 各类细胞的表示法一般有三种： a.单线条法：适用于薄壁细胞。b.双线条法：适用于略增厚壁的细胞。c.三线条法：适用于成群的厚壁细胞及导管；如单个散在时，采用双线条法。 B、HB铅笔：适于绘粗线条。如绘厚壁细胞、导管的外缘线。 H、2H铅笔：适于绘中线条。如绘薄壁细胞，各种结晶体、淀粉粒等。 3H铅笔：适于绘细线条。如绘厚壁细胞、导管的内缘线、层纹、纹孔等。 修正铅笔图 将勾画的轮廓图用不同型号的铅笔和项中规定的画法修整成铅笔图。 图注和图名 按简图法写上图注、图名和放大倍数。 注意事项 组织详图是细胞的平面图，但细胞内含物以及厚壁细胞应注意绘出立体感。 4药材粉末图绘制法 粉末图是描绘粉末药材中具有鉴别意义的组织碎片、细胞或细胞内含物形态的特征图。绘制方法如下： 制作合适的粉末标本片，仔细观察。 用描绘器作图或镜检时直接作图。 选择有鉴别意义的特征，如实描绘。常见的粉末特征：导管、各种厚壁细胞、内含物、分泌组织、毛茸等。注意观察和描绘不同的角度和断面：如表面观、断面观、极面观、赤道面观等。 注意绘出立体感：如各种厚壁细胞、内含物、毛茸、导管等。 图版的排列、大小和放大倍数 图版排列的原则为各类特征相对集中，又要与其他特征适当交叉、美观、充实、大方；图版大小一般按各出版社要求的大小或其倍数计算；同一张粉末图中，要求使用同一个放大倍数。 修正铅笔图 按详图绘制法中4、5项进行。 图注和图名 铅笔图绘完后，将各类粉末特征标上数码，在图下写明，图的名称、放大倍数，其下面注明特征数码的图注。 注意事项 图版排列时，应注意突出重点特征，使占主要版面，次要特征占次要版面或填补空隙，既不能过于密集繁杂，又不能过于稀疏松散，切忌不可纵、横排队式。图片的大小要适中，根据图纸的大小和图的多少确定。 5药材解离组织图的绘制法 根据材料的性质，选择合适的解离方法、制片，用描绘器进行描绘。 解离组织是观察研究药材某一组织中有鉴别意义的单个完整的细胞形态，故描绘时，单个细胞应绘全形图，过长的细胞，如纤维、管胞、筛胞等，可分上下两段描绘。描绘时，应体现立体感，各种细胞的鉴别点要绘出来，如细胞的纹孔、导管穿孔板、纤维末端的分枝等。 图版排列，一般各类细胞在图中分类集中纵向排列。同一图版中，可以使用不同的放大倍数，在图注中，分别注明放大倍数。其他与粉末图相同。 六、显微摄影 显微摄影技术(microscopic photography)也称显微照像术，是利用摄影技术和显微镜把显微镜中观察到的组织、细胞图像记录下来，并以照片或幻灯片的形式供保存、观察、测量和分析鉴定。显微摄影一方面是探求奇异的微观世界，记录新鲜、罕见。另一方面是科学家、医学工作者用来记录潜心钻研、刻苦追求的成果。 显微摄影拍摄的标本，多用石蜡或冰冻以后，切成薄薄的一片，固定在载玻片上，送到显微镜下观察和拍照。标本的色彩并不是原来物质的颜色，而是为了区分不同组织或物质所作的染色。染色方法、材料不同，可出现各种不同的色彩组合。作为科学家、医学工作者来说，要设法最清晰地表达不同组织或物质，从而证明自己的研究工作。 1.显微摄影装置 显微摄影装置最基本的结构就是：各类显微镜和各类照相机。传统的显微摄影一般使用传统的相机，将镜头去除，装在显微镜上，拍摄显微镜下看到的切片；或者使用专门的照相显微镜，有自己的专用片盒，可以拍35mm胶片，也可拍一次成像和4×5页片，对焦、光圈、曝光全在显微镜上操作完成，除了连续照明外，甚至装有闪光灯和色温表，自动曝光系统既可点测光也可中心重点测光，曝光补偿、倒记数显示等等，一应俱全。传统的显微摄影有着和传统相机一样的缺点：拍摄的照片，不能立拍即现，照片必须要经过冲洗，在数字化成电子文挡的时候，细节有损失等等。 数码显微摄影在装置上，一般使用数码相机通过各种接口和显微镜的组合，然后数码相机和计算机相连；数码显微摄影的优点在于，可即时浏览拍摄，拍摄后的照片即时观看，减少废片率；另外拍摄后的照片即时传入到计算机的分析软件，即刻得出分析接结果，大大缩减了因冲洗照片而耽误大量时间，从而解决了实验的连续性的问题；再者，数码显微摄影拍摄的图片为数字化的文档，可即刻用于power point教学或日后的编辑出版工作。 2.胶卷或存储卡的选择 普通显微照像选择胶卷为图像的载体 胶卷按色彩分为黑白和彩色的，按尺寸大小分135、120、波拉片(一次成像)等，按感光灵敏度分高感光度(ISO4003200度)、中感光度(ISO50200度)、低感光度(IS01225度)，按成像性质分负片和反转片，按色彩要求分日光型和灯光型。 用于显微摄影的理想胶卷应该是：高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度高。 数码显微照像选择存储卡或记忆棒为图像的载体 存储卡或记忆棒，其主要功能是记录不同类型的数字化内容，并且在不同的产品中进行分享和交流。其特点在于小巧、轻量、可靠并且易于操作，各种数字化内容都可以储存在上面。一般有32M、64M、128M或更大的内存。在内存容量相同的情况下，数码相机所拍照片的存储格式与拍摄方式成一定的比例。普通情况下建议使用JPG的存储格式；因为这种格式存储空间小，便于网上传送；特殊情况下，可以使用TIF 的存储格式，这种格式占用存储的空间大，但画面清晰度高，便于后期编辑。此外，某些相机支持在同一张卡上存储多种格式。 从技术上讲，数码相机使用的影像传感器与胶卷十分类似，因此也可以仿照传统相机换用不同速度胶卷的形式那样设定不同的感光度，其成像质量与传统胶卷也十分类似：感光度越高，颗粒度越大。不过，胶卷的颗粒度来源于乳剂中的化学制剂粒子，而影像传感器的“颗粒度”则是电子信号的干涉现象或噪音信号造成的。而且，数码相机改变感光度设置无需像传统相机那样更换不同速度的胶卷，这使得摄影者可以根据环境光情况随时调整感光度，根据需要使用适当的快门速度和光圈组合。 3.显微摄影装置的使用 在显微摄影的操作中，标本和显微镜的调节与普通观察使用没有什么不同，但更要求严格按程序操作。常用的显微摄影可分两种，一种是在摄影光路分出一个侧目镜。调节此侧目镜的调焦环至其中的以“+”字的线条呈分开的双线(四对)，在此看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另一种是不带侧目镜的，而是在观察目镜中有一片带格标尺，调节观察目镜上的调焦环至有格标尺清晰，在此看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另外，可根据需要来设置感光度、快门时间或自动曝光、重拍、连拍、数值记录等。这些装置在摄影系统上都较直观，易操作。 (1)拍摄操作的基本步骤 1)手控显微摄影装置拍摄 将胶片装入照相机，并将相机安装在显微镜上。把将要拍摄的切片置显微镜下，开启光源，找到欲摄部位；选择镜头大小和接目筒的长短确定放大倍数；根据切片颜色和要突出的部位选择滤色片。如果光源是外来光源，反光镜要用平面镜，利用集光器调节，以获得较高的分辨率和反差。在物镜调节清晰后，进行曝光。先通过试拍确定曝光可能需要的时间，然后在快门上拨正刻度。照相机上的刻度有“T”，为使用lmin以上的长时间者，开后不会自闭，到时需把它关上；“B”为使用lmin以下者，开了能放手，到时将手一松，快门自闭；其他还有2s、1s、1/2s、1/3s等，这些开了到时会自动关闭。快门速度调好后，即可按动快门，进行曝光。 由于数码相机采用的是电子感光器件CCD或CMOS感光成像的原理；因此，当快门按下后，存在一个比较短的延迟时间。在这段约半秒钟的时间里，如果你的手稍有抖动，便会使图像变虚，从而影响拍摄质量。这种情况在近距拍摄或显微拍摄时更为明显。因此，当按下快门时，需要用手将相机机身端稳，并保持几秒钟的静止；如果拍摄近距或显微样品时，最好固定好照相机并使用快门线拍摄。 2)全自动摄影显微镜拍摄 将胶卷装入暗盒内。按说明书连接电路。检查电路是否正确连接，一切正确后，开启光源，检查拍摄装置进行情况。在载物台上安置欲摄像的显微标本片，并调节至物像清晰，同时选择好拍摄部位调节至视野中心。调节控制台控制旋(按)钮，核对胶卷定数，同时将控制定数旋钮转至胶卷定数。将通光量调节旋钮转到(根据标本要求)适当度数。调节电压控制旋钮至5，再转动控制台亮度旋钮，直到显微镜视野内现黄色取景框“ ”，推进显微镜载物台的推进器，把拍摄部位移入取景框就是底片曝光范围，只有在取景框内的组织才能摄进底片，亮度指示(黄色圆斑点)在欲突出的中心目标上。按下曝光速度显示按钮，记录曝光时间。按初曝光快门按钮，拍摄即告完毕。 (2)显微摄影需注意的问题 1)滤光片的选择 显微摄影对滤光片的使用比一般观察时要重要得多，尤其是彩色摄影时滤光片配合得不好，会使拍摄效果大失水准。 拍摄黑白胶卷：为了达到最高分辨力和反差，应选用与标本颜色互补的单色滤光片。如橘红色的标本，选用蓝色滤光片；紫红色的标本，选用绿色滤光片等。较简单的方法是：换用各种颜色的滤光片观察一下，镜下的视觉与将在胶片上形成的效果相似。 拍摄彩色胶卷：使用滤光片要考虑的因素较多。如用灯光做光源的显微镜，选用日光型胶卷时，在光路上要加蓝色滤光片(如雷登80A型滤光片)把光线色温从3200K左右提高到5500K左右，适合于日光型胶卷对光色温的要求。否则，拍出的照片会偏色。滤光片的选择要根据需要的效果、所用的标本状况，光源性质和胶片特性等灵活掌握。例如，显微荧光摄影时，虽然用的是灯泡光源，但却不是发3200K色温的普通钨丝灯泡，而是高压汞灯，发出的是短波长光线，靠它激发产生荧光，故不能再加任何摄影用滤光片；再如用相差显微镜拍摄时，标本往往是无色透明，但在相差显微镜下呈现黄绿色，较适合人的视觉心理。此时，没有必要再去校正色温。否则，反而感到不真实。 2)选择质量好的标本图像，这是拍摄到满意照片的前提，应引起拍摄者的高度重视。要选择合适的感光材料。 3)严格地调整显微镜，调整不当所导致的不良现象，在普通观察时不易察觉到。但在照片上的差异却特别引人注目，如视野内亮度不均匀。调焦要准确。一是对目镜的调焦，一是对标本物镜的工作距离。 4)光线强度要适当，使标本图像的反差，色彩饱和度达到满意。感光过程中应绝对避免振动，即使不易被察觉到的振动，也足以导致记录图像的模糊。感光要正确。测光表提供的感光时间仅是参考。尽管多数情况下此值与正确感光值是一致的。测光表是依视野灰度18为根据，测其亮度而提供感光时间的。但许多情况下视野灰度大大偏离18，所以实际的感光时间必须补偿。如暗背景的感光量应比测得值减少12倍；明视野背景下的很小面积的图像时应增加12倍。 5）在数码照像时，不同焦距的微距镜头，应用特点有所不同，具体是： 在同一像场比下，镜头的焦距越短则摄距越近；对同一摄距而言，焦距越长的镜头拍摄的画面越大；短焦距镜头可强调画面的透视感，长焦距镜头可压缩画面、模糊背景、更好地突出主体。使用微距镜头显微拍摄时，要根据拍摄倍率进行适当的曝光补偿，一般微距镜头使用说明书上都推荐有相应的曝光补偿数据，许多变焦镜头也有微距拍摄功能(严格意义上讲应称为“宏功能”或高倍拍摄功能，因为许多标MACRO字样的变焦镜头，高倍率拍摄时拍摄距离并非很近)，但与定焦距镜头微距功能相比仍有差距。一是拍摄倍率较小，一 般只为1：4，甚至于更小(如尼康一镜头在200mm焦距下的最大微距拍摄倍率仅为1：59，在80mm焦距下仅为1：14)，只有极少数达到1：2；二是用变焦镜头微距档拍摄的成像质量不如定焦距微距镜头高。微距镜头给近距离拍摄较小物体提供了方便，但使用微距镜头进行微距拍摄时，景深很小，聚焦要十分仔细，并要尽可能将照相机架在三脚架或翻拍架上拍摄。 4暗室技术 一般地说，彩色片(包括负片和反转片)必须送到专业店去冲扩。而黑白感光材料处理容易，效果易控制，出样快等，适合于就地冲扩，被大多数实验室所采用。有关黑白照片冲扩使用的感光纸、显影液、定影液等材料的选择，以及冲洗胶卷、印放照片、照片修整等技术省略，请参考有关专业专籍。数码照像后的数码图片，可以转入电脑中存储或修改，也可送专业图片扩印店进行冲扩或制版。 七、实验操作 1装好测量目尺和物尺，按下列计算公式校对显微测量目尺。 物尺格数×物尺每格长度 计算公式：目尺每小格代表长度= 目尺格数 2取大黄、肉桂粉末，分别以水合氯醛透化装片，练习测量大黄簇晶直径、肉桂纤维直径及长度。 3取软化好的牛膝药材，练习徒手切片。取切的薄而完整的牛膝横切片，用水合氯醛加热透化后，置显微镜下观察。 1记录显微测量中，目镜量尺每一小格的微米数。写出大黄簇晶直径、肉桂纤维直径和长度的显微测量结果。 2观察牛膝横切面组织特征，练习横切面简图的绘法。